[发明专利]一种同时制备D-和L-型叔亮氨酸的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物催化领域，特别涉及一种同时制备D-和L-型叔亮氨酸的方法。

背景技术

L-叔亮氨酸和D-叔亮氨酸是非常重要的非天然氨基酸，是多种药物的中间体。因其侧链是一个叔丁基，有很大的空间位阻，在和其它分子耦联后有利于维持空间构象，同时形成的酰胺键不容易被体内的酶识别降解。目前合成L-叔亮氨酸和D-叔亮氨酸，除化学拆分法，生物催化的工业化方法主要是以叔丁基酮酸为底物，用脱氢酶进行生物还原氨法进行，如《一种制备L-叔亮氨酸的方法》201110202325和《D-叔亮氨酸的一种生物催化制备方法》CN104513839A。有文献报道用固定化亲霉素酰化酶，拆分酰化的混旋叔亮氨酸，但通过发明人的实验表明，固定化亲霉素酰化酶，耐受的底物浓度较低，超过200mM几乎无活性，使用二次后，活性极显著下降。专利《连续化酶法生产L-叔亮氨酸》201010622182，是采用苯乙酰基修饰混旋叔亮氨酸，用固定化的Amano酰化酶在室温进行拆分，酶依赖进口，苯乙酰基修饰的叔亮氨酸在室温条件下溶解度较低，工艺对生产不利。

发明内容

本发明的目的是提供一种制备混旋D-,L-叔亮氨酸的方法。另外本发明提供一种同时制备D-型叔亮氨酸和L-型叔亮氨酸的方法，上述制备方法其综合成本显著低于生物还原转化方法。

本发明包括以下内容：

一种制备混旋D-,L-型叔亮氨酸的方法，包括以下步骤：

步骤（1）：将正丁醇与1,1-二氯乙烯反应，得到3,3-二甲基丁酸产物；

步骤（2）：在3,3-二甲基丁酸产物中加入催化剂，同时通入空气和氯气，进行氯代，得到2-氯-3,3-二甲基丁酸；

步骤（3）：将得到的2-氯-3,3-二甲基丁酸进行氨解反应，最终得到混旋D-,L-叔亮氨酸。

一种同时制备D-叔亮氨酸和L-叔亮氨酸的方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤（1）：将正丁醇与1,1-二氯乙烯反应，得到3,3-二甲基丁酸产物；

步骤（2）：在3,3-二甲基丁酸产物中加入催化剂，同时通入空气和氯气，进行氯代，得到2-氯-3,3-二甲基丁酸；

步骤（3）：将得到的2-氯-3,3-二甲基丁酸进行氨解反应，得到混旋D-,L-叔亮氨酸；

步骤（4）：用乙酰氯或氯乙酰氯修饰步骤（3）中所述的混旋D-,L-叔亮氨酸，对得到的乙酰化D,L-叔亮氨酸或氯乙酰化的D,L-叔亮氨酸利用L-氨基酰化酶进行拆分；

步骤（5）：将拆分回收得到的乙酰化的D-叔亮氨酸或氯乙酰化的D-叔亮氨酸去酰化，结晶得到D-叔亮氨酸；将拆分回收得到的乙酰化的D-叔亮氨酸或氯乙酰化的D-叔亮氨酸进行消旋，再用L-氨基酰化酶进行拆分，得到L-叔亮氨酸。本发明由于采用了低成本的正丁醇与1,1-二氯乙烯作为起始原料，得到的D-和L-叔亮氨酸成本远低于生物还原转化方法。

进一步地，L-氨基酰化酶为L-热稳定氨基酰化酶。关于L-热稳定氨基酰化酶的制备方法可参见AthermostableL-aminoacylasefromThermococcuslitoralis:cloning,overexpression,characterization,andapplicationsinbiotransformations.Extremophiles.2002Apr;6(2):111-122。

本发明为克服苯基衍生物酰化叔亮氨酸溶解度低的不足，采用乙酰氯或其衍生物修饰叔亮氨酸，避免苯基导入对酰化叔亮氨酸溶解的不利。同时采用L-热稳定氨基酰化酶在较高温度下进行拆分，进一步提高酰化叔亮氨酸的溶解度，可实现高效率的生物催化。

由于用氯乙酰氯修饰D-,L-叔亮氨酸，并在较高的温度下，如70-80℃,用L-热稳定氨基酰化酶进行拆分，有效的增加了底物的浓度，实现了高效率拆分。

作为优选，当正丁醇与1,1-二氯乙烯反应，反应体系的温度在0-2℃，反应时间为3小时。

作为优选，步骤（2）在3,3-二甲基丁酸产物中加入催化剂，所述催化剂为红磷。

本发明还提供一种制备L-叔亮氨酸的方法，包括以下步骤：

步骤（1）：将正丁醇与1,1-二氯乙烯反应，得到3,3-二甲基丁酸产物；

步骤（2）：在3,3-二甲基丁酸产物中加入催化剂，同时通入空气和氯气，进行氯代，得到2-氯-3,3-二甲基丁酸；

步骤（3）：将得到的2-氯-3,3-二甲基丁酸进行氨解反应，得到混旋D-,L-叔亮氨酸；