[发明专利]基于FISH的厌氧消化发酵液中产甲烷菌群的检测方法

说明书

本发明公开一种基于FISH的厌氧消化发酵液中产甲烷菌群的检测方法：在分离去除发酵液中发酵残余物后再对分离产物进行荧光原位杂交。本发明利用分层离心方法使菌体、发酵残余物按照自身不同密度分散在碘海醇溶液的不同位置，效果明显，从而解决发酵残余物对杂交效果的影响；本发明还系统优化针对厌氧消化液中产甲烷菌的荧光原位杂交技术各项条件，使杂交的准确性和灵敏性大大提高，对今后FISH技术在厌氧发酵过程中产甲烷菌的检测具有重要意义。通过上述改进，本发明最终解决了FISH技术检测菌体时常常出现的杂质过多，镜检背景昏暗，计数不准确以及试验条件不明引起的杂交效果不理想等问题。

技术领域

本发明涉及检测厌氧消化液中微生物种类的分子生物学方法，是一种基于FISH的厌氧消化发酵液中产甲烷菌群的检测方法，即一种检测厌氧消化发酵液中产甲烷菌群的荧光原位杂交方法。

背景技术

沼气发酵是一种由多种降解微生物参与的极其复杂的生物化学过程，分为水解，酸化，产甲烷三个阶段。整个发酵过程是一个产甲烷菌与非产甲烷菌相互作用，相互制约的过程。非产甲烷菌为产甲烷菌提供代谢底物，产甲烷菌利用有机酸和H₂生成CH₄，从而为非产甲烷菌解除反馈抑制从而促进其生长。发酵液中有机酸、氨氮等物质的积累会抑制产甲烷菌的活性，从而打破这种平衡，造成产气失败。同时优势产甲烷菌受环境条件影响，也在不断变化。因此研究消化液中厌氧菌的组成、结构和功能对防止有机酸积累和氨抑制及掌握菌群随底物变化的规律有重要作用。

利用荧光标记的探针在细胞内与特异的互补核酸序列杂交，通过激发杂交探针的荧光来检测信号的FISH技术近几年在水污染控制微生物生态学的研究中得到一定发展。利用FISH技术可掌握微生物在发酵液中的数量、形态和分布，但在应用中还存在诸多问题需要改进，例如杂交过程的各种条件包括杂交和洗脱温度、变性剂浓度、探针浓度都需要优化，这些杂交条件关系着探针与被检测物结合的强度和FISH的检测效果。另外，FISH技术是利用荧光探针按照碱基互补配对原则在菌体内部与同源16SrRNA特异结合，发酵残余物附着在菌体表面及周围，在很大程度上会使荧光探针的穿透率不足，从而导致杂交率低及细胞观察准确率低等问题。

发明内容

针对上述现有技术的缺陷，本发明提供了一种基于FISH的厌氧消化发酵液中产甲烷菌群的检测方法，即检测厌氧消化发酵液中产甲烷菌群的荧光原位杂交技术，首先提出了一种有效分离菌体与发酵残余物的方法，利用分层离心的方法使菌体、发酵残余物按照自身不同密度分散在碘海醇溶液中的不同位置，分离效果明显，从而解决了发酵残余物对杂交效果的影响；另外，本发明系统的优化了针对厌氧消化液中产甲烷菌的荧光原位杂交技术从稀释倍数、变性剂浓度、杂交温度、湿度及时间到杂交液和洗脱液的配制，探针的浓度等的各项条件，使杂交的准确性和灵敏性大大提高，对今后FISH技术在厌氧发酵过程中产甲烷菌的检测具有重要意义。通过上述改进，本发明最终解决了FISH技术检测菌体时常常出现的杂质过多，镜检背景昏暗，计数不准确以及试验条件不明引起的杂交效果不理想等问题。

本发明是通过以下的技术方案实现的：

本发明提供一种基于FISH的厌氧消化发酵液中产甲烷菌群的检测方法，所述检测方法具体为：在分离去除发酵液中发酵残余物获得分离产物后再对分离产物进行荧光原位杂交。

优选地，所述分离具体采用离心的方式；

优选地，所述离心的条件为13000rpm、30min，此步是发酵液中所有物质通过离心在碘海醇溶液中均匀分布的过程，离心时间低于30min则菌体和发酵残余物来不及在碘海醇溶液和水相中充分分布，降低分离效果，离心时间高于30min可导致本应处于碘海醇溶液与水相交界处的菌体因过度沉降而转移到碘海醇溶液层，降低分离效果；

优选地，所述离心是在向所述发酵液中加入碘海醇溶液后进行的；