[发明专利]利用膜片钳技术筛选乳源中促睡眠肽粗提物的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种促睡眠保健品领域，特别是一种从乳源中分离纯化促睡眠肽的方 法及用途。

背景技术

睡眠作为生命所必须的过程，是机体复原、整合和巩固记忆的重要环节，是健康不 可缺少的组成部分。世界卫生组织的一项研究表明全球约有27%的人在遭受失眠病症的困 扰。在我国约有3亿成年人患有失眠疾病。目前失眠症在世界上仍是一个没有得到充分重视 和良好解决的公共卫生问题。

临床上常用化学合成类镇静催眠药治疗失眠及其他疾病引起的睡眠障碍。此类药 物在延长睡眠时间的同时，都会出现不同程度的副作用如头晕、乏力、困倦、注意力不集中， 甚至暂时性健忘和宿醉现象，并未真正起到改善睡眠质量的作用。因此，提供药效显著、副 作用小、安全的改善睡眠作用的药物是医药卫生领域的一项重要任务。其中，建立快速、有 效的改善睡眠作用药物的药效评价方法，对药物进行筛选和评价是实现这一任务的前提和 基础。

大脑中存在着由一系列神经核团纤维和递质所组成的睡眠、觉醒调节系统，彼此之间 形成既有形态上联系又有功能上制约的神经网络。下丘脑内视前区及其邻近基底前脑神经 元为睡眠发生系统。视前区的促眠神经元主要位于下丘脑腹外侧视前区(VLPO）对睡眠的产 生和维持有着至关重要的作用。

自1976年膜片钳技术诞生以来，利用膜片钳技术进行电生理学的研究已成为一种 重要的研究手段。离体脑片是指从动物脑区制备的脑组织薄片，可在体外人工脑脊液中存 活数小时到十几小时，并能保持与在体脑组织相似的代谢特性和电生理特性。本发明将脑 片膜片钳技术与红外微分干涉相差技术相结合，建立红外可视脑片膜片钳实验技术，使离 体脑片的电生理研究扩大到下丘脑、大脑皮层、小脑、海马、纹状体、脑干等几乎所有的脑区 及脊髓薄片。

牛乳中含有多种生物活性多肽，天然牛乳中活性多肽的含量较少，无法满足亚健 康人们的需要。牛乳蛋白，是许多具有潜在生物活性物质的前体，通过蛋白酶酶解作用，得 到具有生物学功能的小肽，即乳源生物活性肽。这些小肽一般由2-20个氨基酸残基组成，能 够对机体的消化系统、心血管系统、免疫系统等多方面产生积极的影响，具有调节神经系 统、抗菌、抗氧化、抗高血压、免疫调节等生理活性。牛奶制品长期以来被认为具有促进睡 眠，缓解压力的作用，法国科学家已证实牛奶制品中的一种酪蛋白酶解产物具有明确的抗 抑郁，缓解压力的生物活性，但其具体机制和具体物质一直没有明确。

目前，国内膜片钳实验技术的应用并不广泛，且以盲法为主，缺少高质量的体视显 微镜和水浸物镜是一方面的原因，而主要难点是制备活性良好的脑片。另一方面，乳源制品 具有调节睡眠的活性，但缺乏合适的模型对其活性进行评价。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用膜片钳技术筛选乳源中促睡眠肽粗提物的方法，其利 用乳源多肽等电点（pH）、溶液极性（乙醇浓度）对其进行粗分离，定量分析各性质部分所占 比例（沉淀得率），并借助制备液相制备样品，对酪蛋白酶磷酸肽副产物进行分离纯化。所得 粗提取不仅可以缩短入睡的时间，还可以调节睡眠节律，为失眠症患者的健康提供更好的 保障。

为实现上述目的，本发明的实施方案为：一种利用膜片钳技术筛选乳源中促睡眠 肽粗提物的方法，包括以下步骤：

（1）在容器中加入水，升温至40℃-60℃，加入牛乳和蛋白酶进行酶解，酶解条件为：水 和牛乳体积比为100：10-15、pH值7.5-8.5、时间2-4h，所述蛋白酶为胰蛋白酶和胃蛋白酶， 胰蛋白酶的加入量为牛乳质量的0.2%-0.6%，胃蛋白酶的加入量为牛乳质量的0.06%- 0.12%，酶解完成后，灭酶，喷雾干燥，得粉状酪蛋白水解物；

（2）酪蛋白水解物通过等电点沉淀分离，条件为pH4.5-6、乙醇浓度60%-90%、沉淀时间 为1-3h；

（3）采用反相钢柱，将步骤（2）所得沉淀物通过制备液相，再次对样品进行分离纯化，根 据样品极性的不同，将样品分为若干段，通过建模，对该促睡眠粗体物进行活性评价；

（4）急性分离大鼠的下丘脑腹外侧视前区脑片，厚度约300-500um，然后采用全细胞膜 片钳技术，借助去极化方波，给予30-60PA,3000-4000ms诱发动作电位，给药100-150μmol /L,记录电生理图谱，通过放电数目和频率，筛选出具有较好促睡眠的活性片段。