[发明专利]一种定点突变改造的酵母二肽基肽酶III

说明书

技术领域

本发明涉及一种二肽基肽酶III，特别涉及一种定点突变改造的酵母来源的二肽基肽酶III。

背景技术

二肽酶III(DPP_SIII，EC3.4.14.4)，如来自酵母的二肽酶III、来自人类的二肽酶III、来自大鼠的二肽酶III、来自兔的二肽酶III等，是一组分子内含有特殊的HEXXGH锌指结构的金属蛋白酶，具有水解多肽链的氨基末端切掉二肽的肽酶。DPPIII在生理功能上与脑啡肽和血管紧张素II、血管紧张素III、促黑色素等重要的生理活性肽的新陈代谢有关。DPP_S存在于各种哺乳动物的组织中，根据亚细胞的定位、特异性地无核抑制剂的敏感性，二肽基肽酶分成不同的类型DPPI～DPPIV。DPPIII可以选择性地从多肽链或蛋白质的N-末端水解掉二肽残基，如：Arg-Arg-，Ala-Arg-，或者Tyr-Gry。酵母来源的DPPIII由712个氨基酸组成，锌离子是其催化金属离子。其氨基酸序列与黄曲霉毒素单加氧酶(Aflatoxinmonooxygenas，AFMO)的同源性达到37％，但不具有对6-甲氧基双呋喃香豆素氧化分解的功能。

黄曲霉毒素主要是由黄曲霉和寄生曲霉等真菌产生的剧毒性次生代谢产物，已经确定的黄曲霉毒素分子的结构主要有八种，其中毒性最强的黄曲霉毒素B1(也称6-甲氧基双呋喃香豆素)被认为是潜在的对人类危害极为突出的一类强致癌诱变剂，一次大量摄入会引起人及动物的急性中毒、甚至死亡；小剂量长期摄入会致畸、致突变和致癌，即使几十ppb的含量仍有极大的毒性；I族黄曲霉毒素含有呋喃双键结构。目前，已经发现的对6-甲氧基双呋喃香豆素具有分解作用的生物酶极少。黄曲霉毒素单加氧酶(AFMO)是一个对6-甲氧基双呋喃香豆素有氧化分解作用的酶。经研究发现黄曲霉毒素单加氧酶氧化分解6-甲氧基双呋喃香豆素的过程为：从底物分子中获得电子传递给氧，使水还原成过氧化氢，将底物氧化并进一步使分子中的呋喃双键开环。在这个过程中，由分子内的变价离子的价态变化来实现电子的传递，首先，结合在AFMO上的二价金属离子夺得底物的一个电子，自身变成一价离子，然后不稳定的一价离子将夺得的这个电子传递给氧，自身又转变成稳定的二价离子，氧气分子获得一个电子在水分子的参与下生成过氧化氢，同时底物转变为它的环氧化物。然后，该环氧化物伴随着过氧化氢的作用发生氧化水解反应，最终使底物分子中的呋喃双键断开。黄曲霉毒素单加氧酶是目前已报道的用于黄曲霉毒素解毒的生物酶。因此，发现和制造新的对6-甲氧基双呋喃香豆素具有氧化分解作用的酶，对发展黄曲霉毒素消减技术具有十分重要的现实意义。

发明内容

本发明的首要目的是提供一种定点突变的酵母二肽基肽酶III，该酵母二肽基肽酶III突变体对6-甲氧基双呋喃香豆素具有氧化分解功能。

本发明所述的一种定点突变改造的酵母二肽基肽酶III是由氨基酸序列为SEQIDNO.1的来源于酵母SaccharomycescerevisiaeS288c的酵母二肽基肽酶III(NCBI数据库登录号为NM_001183312)中制造多个氨基酸取代而产生的、对6-甲氧基双呋喃香豆素有氧化分解作用的酵母二肽基肽酶III突变体，所述的氨基酸取代包括第570、572和574位的取代。

根据本发明所述的定点突变改造的酵母二肽基肽酶III的进一步特征，所述第570位的氨基酸用丙氨酸(Alanine，ALa,A)取代赖氨酸(Lysine，Lys,K)；第572位的氨基酸取代是用赖氨酸(Lysine，Lys,K)取代甘氨酸(Glycine，Gly，G)；第574位的氨基酸取代是用组氨酸(Histidine,His,H)取代色氨酸(Tryptophan,Trp,W)；所述的定点突变改造的酵母二肽基肽酶III突变体的氨基酸序列为SEQIDNO.2。

经实验验证，本发明所述的定点突变改造的酵母二肽基肽酶III(以下缩写为“myDPP”)具有对于6-甲氧基双呋喃香豆素的氧化分解功能。该突变体酶在pH6.0、反应温度25℃处理6-甲氧基双呋喃香豆素(100ppb)50分钟后，其对6-甲氧基双呋喃香豆素的氧化分解效率达到90％。该突变体酶的其它酶学性质与野生酶相似。

进一步地，本发明提供了一种DNA分子，其编码本发明所述的定点突变改造的酵母二肽基肽酶III。

优选地，本发明所述的DNA分子的核苷酸序列为SEQIDNO.3。

本发明的另一个目的是提供一种载体，其含有本发明所述的DNA分子。