[发明专利]一种将T淋巴细胞诱导成多能干细胞的方法

说明书

本发明涉及细胞培养技术领域，特别涉及一种将T淋巴细胞诱导成多能干细胞的方法。该方法包括：将含有干细胞转录因子基因的仙台病毒转染T淋巴细胞，获得感染细胞；将感染细胞与饲养层细胞混合，采用饲养层细胞培养基进行第一培养，然后弃饲养层细胞培养基，采用胚胎干细胞培养基进行第二培养，接着采用条件培养基和人胚胎干细胞培养基的混合液进行第三培养，最后采用人胚胎干细胞培养基进行第四培养，最终获得多能干细胞。本发明选择仙台病毒作为转染载体，避免病毒的基因组整合到供体细胞的基因组中，提高了iPS细胞的安全性；选择外周血T淋巴细胞作为iPS细胞的供体细胞，供体细胞来源简单；本发明方法可成功获得多能干细胞，其多能干细胞的转化率和纯度均较高。

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域，特别涉及一种将T淋巴细胞诱导成多能干细胞的方法。

背景技术

胚胎干细胞(embryonic stem cell，ESCs，简称ES、EK或ESC细胞)是早期胚胎(原肠胚期之前)或原始性腺中分离出来的一类细胞，它具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性。无论在体外还是体内环境，ES细胞都能被诱导分化为机体几乎所有的细胞类型。胚胎干细胞在组织工程与再生医学等领域极具应用价值。

作为被称之为“种子细胞”的ES细胞，为临床的组织器官移植提供大量材料。人ES细胞经过免疫排斥基因剔除后，再定向诱导终末器官以避免不同个体间的移植排斥。这样就可能解决一直困扰着免疫学界及医学界的同种异型个体间的移植排斥难题。ES细胞可用于细胞治疗，细胞治疗是指用遗传工程改造过的人体细胞直接移植或输入病人体内，达到治愈和控制疾病的目的。ES细胞经遗传操作后仍能稳定地在体外增殖传代。以ES细胞为载体，经体外定向改造，使基因的整合数目、位点、表达程度和插入基因的稳定性及筛选工作等都在细胞水平上进行，容易获得稳定、满意的转基因ES细胞系，为克服目前基因治疗中导入基因的整合和表达难以控制，以及用作基因操作的细胞在体外不易稳定地被转染和增殖传代开辟了新的途径。

然而，由于其难以获得且涉及敏感的伦理问题，使得研究一度陷入尴尬境地。2006年8月，日本Yamanaka研究小组向小鼠成纤维细胞内导入4种转录因子基因(Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4)，成功地将其重编程为ESCs样诱导性多能干细胞(inducedpluripotentstemcells，iPSCs)。2007年底，日本Yamanaka小组和美国Thomson小组相继将这一革命性技术在人类细胞中得以实现。iPSCs的研究是一项具有开创性治疗性克隆的基础研究，避开了长期以来ESCs难以获取且极易引发伦理争议的问题，为干细胞医学应用开辟了一条新的途径，被认为是干细胞领域乃至整个生物学领域的重大发现。包括英国爱丁堡大学Ian Wilmut教授在内的许多科学家均认为诱导性多能干细胞才是干细胞未来的研究方向。iPSCs细胞不仅对于干细胞研究具有重要的理论意义，而且在细胞治疗、组织器官再生、药物筛选与评价等领域极具应用价值。

然而，iPSCs的安全性是临床应用前必须考虑的问题。用于介导目的基因的多数病毒载体可整合到靶细胞基因组中，有可能激活癌基因。为消除iPSCs的安全隐患，研究人员一直在寻求一种更安全的转录因子导入方式。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种将T淋巴细胞诱导成多能干细胞的方法。该方法可成功获得多能干细胞，安全性高，且转化率和纯度均较高。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种将T淋巴细胞诱导成多能干细胞的方法，包括如下步骤：

将含有干细胞转录因子基因的仙台病毒转染T淋巴细胞，获得感染细胞；

将感染细胞与饲养层细胞混合，进行第一培养，采用人胚胎干细胞培养基进行第二培养，然后采用饲养层细胞的条件培养基和人胚胎干细胞培养基的混合液进行第三培养，最后采用人胚胎干细胞培养基进行第四培养，获得多能干细胞。