[发明专利]肺炎衣原体荧光PCR检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种采用实时荧光PCR方法特异性检测样品中肺炎衣原体核酸的试剂盒，属于肺炎衣原体的体外诊断领域。

背景技术

肺炎衣原体（chlamydiapneumoniae）是衣原体属中的一个新种，只有一个血清型，98kDa蛋白为其特异性抗原，代表株是TWAR，是80年代发现的一种新的能引起人类急性呼吸道感染的病原体，比如青少年及成人的非典型肺炎，以及支气管炎、咽炎及扁桃体炎等，并且与动脉粥样硬化、冠心病、心肌梗塞等疾病有密切关系。肺炎衣原体已是继肺炎链球菌和流感嗜血杆菌之后引起社区获得性肺炎的主要病原体，其传播源是患病者或无症状携带者的呼吸道分泌物和飞沫，与嗜肺军团菌和肺炎支原体一起成为社区获得性肺炎的三种非典型病原体。人感染肺炎衣原体一年四季均可发生，不存在季节性差异，其流行传播可呈散发性或者爆发性，尤其是在空间较封闭、人群聚集较多、空气不太流通的公共场所。在检测中，PCR法由于其快速简便的特点逐渐呈现出要替代以细菌培养和血清学检测为主的传统检测方法的趋势。而对于PCR方法来说，引物的特异性是其检测的特异性和敏感性的基础。

本发明针对肺炎衣原体基因序列的保守区域特异的靶序列设计引物和Taqman探针，利用real-timePCR的方法，用来快速检测样品中是否存在肺炎衣原体的核酸。

发明内容

本发明主要解决的技术问题是快速准确地检测样品中是否存在肺炎衣原体，提供一种特异性检测肺炎衣原体的荧光PCR试剂盒。

本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：

一种特异性检测样品中肺炎衣原体核酸的试剂盒，其组分包括PCR反应液、酶混合液、阴性质控品和阳性质控品，其中PCR反应液主要含有相关的引物和探针、反应缓冲液、Mg²⁺和dNTP等，酶混合液主要含有热启动Taq酶，阴性质控品为无RNase和DNase水，阳性质控品为含有肺炎衣原体检测靶序列的重组质粒。

其中PCR反应液中用于核酸扩增的引物为P1和P2，P1和P2为针对肺炎衣原体基因组群特异性保守序列设计并经预实验筛选出的特异性引物；PCR反应液中用于荧光信号监测的寡核苷酸探针为Probe1，Probe1为针对肺炎衣原体基因组群特异性保守序列设计并经预实验筛选出的特异性探针，其中荧光报告基团X₁为FAM，荧光淬灭基团Y₁为Eclipse（见表1）。

表1检测肺炎衣原体的引物和探针序列

名称序列P15`- GCGCAATAATGGCCTTGCATT -3`P25`- AGTCATTGATGCACTAGCTGTTGCT -3`Probe15`-X<sub>1</sub>- CGTTGGCAACTGAGGCTCGCG -Y<sub>1</sub> -3`

本发明的另一个目的是提供本荧光PCR检测试剂盒在检测肺炎衣原体的应用方法，包括：

试剂盒选用的PCR反应体系为20μl，包括2×PCR缓冲液10μL、10mmol/LdNTP1.0μL、25μmol/L引物各0.5μL、10μmol/L探针0.2μL、热启动Taq酶混合液0.4μL、样品DNA2μL，加灭菌水至终体系20μL。

试剂盒的PCR反应循环参数为94℃，2min；进入循环阶段：94℃变性10s，56℃退火50s，72℃延伸15s，共反应40个循环。