[发明专利]用于全基因组甲基化重亚硫酸氢盐测序的文库构建方法

说明书

本发明提供一种用于全基因组甲基化重亚硫酸氢盐测序的文库构建方法，其适用于中量级别(5～200ng)的起始样本量。该文库构建方法包括从5～200ng的基因组DNA得到片段化的基因组DNA；对上述片段化的基因组DNA进行重亚硫酸氢盐处理，得到单链的重亚硫酸氢盐处理产物；以上述单链的重亚硫酸氢盐处理产物为模板，使用含生物素标记的oligo1引物合成第一条链；使用核酸外切酶消化第一条链合成后体系中的单链DNA；使用链亲和素磁珠调取生物素标记的第一条链；以上述生物素标记的第一条链为模板，使用oligo2引物合成第二条链；以及，以所述第二条链作为模板进行PCR扩增，从而构建二代测序用DNA文库。

技术领域

本发明属于基因检测领域，具体涉及一种适用于中量级别(5～200ng)的起始样本量的用于全基因组甲基化重亚硫酸氢盐测序的文库构建方法。

背景技术

DNA甲基化是基因组DNA的一种最常见的表观遗传修饰，大量研究表明DNA甲基化修饰对于维持正常细胞功能、传递基因组遗传印记、胚胎发育以及人类肿瘤发生等起着至关重要的作用。伴随着高通量测序的诞生，对DNA甲基化的研究越来越深入，作为DNA甲基化检测的金标准，全基因组重亚硫酸氢盐测序(WGBS或BS-Seq，Whole Genome BisulfateSequencing)^[1]，能够对全基因组DNA甲基化进行分析，并且具备了单碱基水平的检测灵敏度。然而，BS-Seq技术建库起始量要求μg以上，高起始量是限制BS-seq在临床样本应用的主要因素。

目前，BS-Seq技术主要用于已完成测序的物种，需要1～3μg基因组DNA起始构建文库。BS-Seq文库构建方法如下，详细流程参考Li等^[1]：

(1)gDNA片段化：1～3μg基因组DNA起始量，采用超声波打断仪片段化gDNA，打断产物直接用于末端修复；

(2)末端修复：以dNTPs为单核苷酸来源，采用T4DNA聚合酶、T4多核苷酸激酶和Klenow片段将打断产物修复成平末端，1.8倍Ampure磁珠纯化；

(3)加“A”：以dATP为单核苷酸来源，采用Klenow(3'-5'exo-)为平末端3'端加A，1.8倍Ampure磁珠纯化；

(4)加甲基化接头：采用T4DNA连接酶将带T的甲基化接头连接在含A的DNA片段两端，1.8倍Ampure磁珠纯化；

(5)重亚硫酸氢盐处理：采用EZ DNA Methylation-Gold Kit对胶回收产物进行重亚硫酸氢盐处理反应；

(6)片段筛选：采用琼脂糖凝胶电泳回收300～350bp范围内的片段，QIA-quickGel Extraction Kit进行胶纯化回收；

(7)PCR扩增：采用KAPA HiFi HotStart Uracil+Ready Mix对胶回收产物进行PCR扩增，扩增产物0.9倍Ampure磁珠纯化，文库构建完成。

2012年，Miura等^[2]提出了Post-Bisulfite Adaptor Tagging(PBAT)全基因组甲基化建库方法，利用Bisulfite处理过程中的损伤作用片段化DNA，接着以单链的Bisulfite产物为模板，以含有生物素标记的Oligo1为引物合成一链(1轮反应)，核酸外切酶I消化合成不完全的单链DNA，再用链亲和素磁珠M280调取一链产物，以一链产物为模板和Oligo2引物合成二链，最后以Illumina公共PE引物和Index引物扩增出文库。2014年，Swallwood等^[3]对PBAT法进行调整后，将基于两条链合成的BS建库方法应用到单细胞全基因组甲基化检测，并将其命名为scBS测序技术，该方法适于利用小量级别(1ng以下)的单细胞全基因组进行甲基化测序。