[发明专利]一种快速鉴别羚牛的分子生物学方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种快速鉴别羚牛的分子生物学方法。

背景技术

羚牛(Budorcastaxicolor)为我国的一级保护动物，栖息于高海拔、高寒悬崖地段，体形较大。往往成为非法盗猎的目标，森林公安在缴获盗猎羚牛酮体时，依赖传统分类形态特征无法将其与牦牛和黄牛区分，存在较大的局限性，不仅费时费力，而且常受主观因素干扰，极易混淆出错。其次，传统的鉴定方法难以开展针对残缺个体的鉴别。

近年来，DNA条形码为物种分类鉴定提供了新的研究方法和手段。DNA条形码，也称为DNA条形编码，类似于超级市场商品包装上用于识别商品的粗细、间隔不同的黑白条纹图案，利用线粒体细胞色素b(Cytochromeb,Cytb)长约1100～1200bp左右的序列，该基因在物种间序列长度没有明显差异，但在核苷酸组成上具有种间的差异。所以Cytb基因作为标记来实现快速、准确和自动化地对物种进行鉴定和分类。DNA条形码快速而精确的特点弥补了传统形态鉴定的诸多不足，使其广泛的应用于动物分类鉴定中。但是目前国内外还没有利用DNA条形码作为分子标记区别鉴定羚牛、黄牛和牦牛的报道。

发明内容

本发明的目的是针对盗猎产生的羚牛酮体或残肢在传统形态学鉴定存在困难，提供一种科学有效、简便快捷、准确的羚牛生物学鉴定方法及DNA条形码引物。

本发明所采用的第一技术方案是，一种快速鉴别羚牛的DNA条形码引物，所述DNA条形码引物为CytbF:5′-TGATATGAAAAACCATCGTTGT-3′，其序列如SEQIDNO.1所示；和CytbR:5′-TTCTTCCTTGAGTCTTAGGGAG-3′，其序列如SEQIDNO.2所示。

本发明所采用的第二技术方案是，一种快速鉴别羚牛的分子生物学方法，包括以下步骤：

1)采用标准酚-氯仿法或DNA抽提试剂盒提取羚牛、牦牛、黄牛总DNA；

2)利用DNA条形码引物扩增羚牛、牦牛、黄牛线粒体Cytb序列进行PCR扩增和测序作为标记；

3)依据羚牛的核苷酸的序列特异性位点进行物种鉴别。

进一步地，步骤1)中为避免动物残肉之间及人的污染，去除表面肌肉，取新鲜无污染的肌肉提取DNA。

进一步地，步骤2)的PCR反应体系为45μL,其中模板DNA为1μL,Mix20μL、浓度为10pM的上下游引物各1.0μL，加水补足20μL体系，在体系表面加2.0μL甘油；PCR反应条件如下：第一阶段95℃预变性8min；第二阶段为95℃变性50s，56℃退火50s，72℃延伸1min40s；35个循环,第三阶段72℃延伸10min,4℃保存及时取出PCR产物，检测扩增效果并测序，得到羚牛、牦牛和黄牛的核苷酸序列，分别如SEQIDNO.3、SEQIDNO.4和SEQIDNO.5所示。

进一步地，步骤2)中利用DNA条形码引物为CytbF:5′-TGATATGAAAAACCATCGTTGT-3′，其序列如SEQIDNO.1所示；和CytbR:5′-TTCTTCCTTGAGTCTTAGGGAG-3′，其序列如SEQIDNO.2所示。

进一步地，步骤3)中依据羚牛的核苷酸的序列特异性位点进行物种鉴别具体为：对羚牛、牦牛和黄牛的核苷酸序列进行分析，得出如下表所示的特异性位点：

如表中的数据所示，表中第一列为特异性位点，第二、三、四列分别为羚牛、牦牛、黄牛在同一行中该位点的核苷酸；牦牛、黄牛在同一位点处的核苷酸相同，而羚牛与这两者不同，当出现表中所示位点处，该位点的核苷酸与牦牛和黄牛的不同时，且牦牛和黄牛在该位点处的核苷酸，则从表中所示的位点判断出为羚牛。

本发明的有益效果是：

1.羚牛、牦牛和黄牛分子生物学鉴别方法能对三个不同生物以及残缺个体进行鉴定，具有准确、迅速、便捷的特点，通常3天就可以完成，比传统的形态学鉴定更准确可靠，既可以节省时间又可以减少费用。

2.羚牛、牦牛和黄牛分子生物学鉴别方法为森林公安的执法提供了精确的分子生物学证据。也弥补了传统形态学鉴定的不足，具有重要的意义。