[发明专利]检测甲状腺球蛋白抗体的试剂盒及方法

权利要求书

1.一种检测甲状腺球蛋白抗体的试剂盒，其特征在于，包括第一试剂、第二试剂、磁分离试剂、化学发光底物、校准品、质控品和清洗液，所述第一试剂为甲状腺球蛋白标记生物素试剂，所述第二试剂为甲状腺球蛋白酶结合物试剂，所述磁分离试剂为链霉亲和素标记的超顺磁纳米磁微粒试剂。

2.根据权利要求1所述的检测甲状腺球蛋白抗体的试剂盒，其特征在于，所述第一试剂或者为甲状腺球蛋白标记FITC抗原试剂；所述第二试剂中的所述酶为碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶；所述第一试剂和所述第二试剂中的甲状腺球蛋白为人源性的天然提取抗原或基因重组抗原。

3.根据权利要求1所述的检测甲状腺球蛋白抗体的试剂盒，其特征在于，所述磁分离试剂为超顺磁纳米磁微粒，所述磁分离试剂中磁珠表面为甲苯磺酰基活化，所述磁分离试剂的直径为1.05μm，等电点是pH5.0，在pH7时，电荷为-10mV，铁含量为26%；所述超顺磁纳米磁微粒直接或间接标记链霉亲和素。

4.根据权利要求1所述的检测甲状腺球蛋白抗体的试剂盒，其特征在于，所述化学发光底物为AMPPD和增强剂的混合物；所述清洗液为浓缩清洗液。

5.根据权利要求1所述的检测甲状腺球蛋白抗体的试剂盒，其特征在于，所述磁分离试剂的制备方法为：将所述磁微粒用0.04~0.06mol/L、pH值为4.5~5的2-吗啉乙磺酸缓冲液重悬，重悬后磁微粒的浓度为8~12mg/ml；然后加入所述链霉亲和素，在15~40℃下混悬30~60分钟，其中所述磁微粒与所述链霉亲和素的质量比为25~50:1；然后再加入新鲜配制的8~12mg/ml的碳二亚胺水溶液，在15~40℃下混悬2~12h，其中所述2-吗啉乙磺酸缓冲液与所述碳二亚胺水溶液的体积比为10~20:1；磁分离，去上清，用含质量比为0.09~1.1%的牛血清白蛋白、pH值为7~7.5、物质的量浓度为0.009~0.01mol/L的三羟甲基氨基甲烷缓冲液重悬到所述偶联有链霉亲和素的磁微粒的浓度为0.2~1.0mg/ml，即得所述磁分离试剂；

所述甲状腺球蛋白（Tg）标记生物素试剂的制备方法为：将所述甲状腺球蛋白（Tg）用0.01~0.03mol/L、pH值为7~7.5的PBS缓冲液，在2~8℃下透析过夜，配制成甲状腺球蛋白（Tg）溶液；将N-羟基琥珀酰亚胺生物素酯溶于二甲基亚砜中配制成N-羟基琥珀酰亚胺生物素酯溶液，其中所述N-羟基琥珀酰亚胺生物素酯的物质的量浓度为8~12mM；将所述N-羟基琥珀酰亚胺生物素酯溶液加入到所述的甲状腺球蛋白（Tg）溶液中，混合均匀，在15~40℃下放置20~40分钟；加入0.9~1.1M的三羟甲基氨基甲烷缓冲液，终止反应，在15~40℃下放置8~12分钟，然后用含质量比为2.5~3.2%的牛血清白蛋白、pH值为7~7.5、物质的量浓度为0.04~0.06mol/L的三羟甲基氨基甲烷缓冲液稀释到含N-羟基琥珀酰亚胺生物素酯标记的甲状腺球蛋白（Tg）的浓度为0.2~2.5μg/ml，即得所述的甲状腺球蛋白（Tg）标记生物素试剂；

所述甲状腺球蛋白（Tg）酶结合物试剂的制备方法为：将甲状腺球蛋白（Tg）加入到浓度为8~12mg/ml的2-亚胺基硫烷盐酸盐偶联剂中，在15~40℃下静置18~25分钟，加入0.09~0.11mol/L的甘氨酸溶液，在15~40℃下静置4~5分钟，用G-25凝胶柱除盐，收集活化后甲状腺球蛋白（Tg），2~8℃保存备用；将碱性磷酸酶溶液加入到4~5mg/ml的4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯溶液中，在15~40℃下静置25~35分钟，用G-25凝胶柱除盐，收集活化后碱性磷酸酶，2~8℃保存备用；将活化后的甲状腺球蛋白（Tg）和活化后的碱性磷酸酶混合，在2-8℃下静置12~24h，用Supperdex200凝胶纯化柱纯化，获得连接物浓溶液，在2~8℃下保存备用；将所述连接物浓溶液用含质量比为0.4~0.6%的牛血清白蛋白、pH为7.8~8.0、物质的量浓度为0.09~0.11mol/L的三羟甲基氨基甲烷缓冲液稀释到含碱性磷酸酶标记的甲状腺球蛋白（Tg）的浓度为0.2~1μg/ml，即得所述的甲状腺球蛋白（Tg）酶结合物试剂。

6.一种检测甲状腺球蛋白抗体的方法，其特征在于，包括步骤为：

步骤1：在检测管中加入待测样本原液，然后依次加入第一试剂和磁分离试剂，混匀，在36~38℃下温育14~16分钟；

步骤2：添加磁场，使步骤1温育后的体系在磁场中沉降，去除上清液，经清洗液多次清洗后，去除磁场，震荡使磁微粒充分混悬；

步骤3：添加磁场，使步骤2混悬后的磁微粒在磁场中沉降，去除上清液，然后加入第二试剂，混匀，在36~38℃下温育14~16分钟；

步骤4：添加磁场，使步骤3温育后的体系在磁场中沉降，去除上清液，经清洗液多次清洗后，去除磁场，震荡使磁微粒充分混悬；

步骤5：添加磁场，使步骤3混悬后的磁微粒在磁场中沉降，去除上清液，然后加入发光底物，去除磁场，充分混悬后检测1秒内相对发光强度值。