[发明专利]无乳链球菌单克隆抗体及其制备方法和用途

说明书

技术领域

本发明涉及一种无乳链球菌单克隆抗体及其制备方法和用途。

背景技术

罗非鱼是原产于非洲的热带鱼类，上世界七八十年代我国多次从国外引种，并选育出长势快、产量高、抗病力强的品种，此后迅速成功推广养殖。目前，我国不仅是世界上最大的罗非鱼养殖生产国，也是最大的罗非鱼出口国。国内罗非鱼养殖集中在广东、海南、广西、福建等南方地区。2009年开始在罗非鱼养殖密集区先后暴发罗非鱼“突眼症”，该病来势凶猛，发病率高达35％，发病鱼死亡率接近100％，且病害持续时间长，药物防治难以控制病情，养殖户损失惨痛。

及时准确的发现和诊断病原，是成功预防和治疗罗非鱼链球菌病的前提。目前，对于无乳链球菌的诊断，主要采用(1)分子生物学的方法，如PCR法进行诊断，该类方法依赖于贵重的仪器设备和专业的技术人员，检测时间长达4-6个小时，非常不利于在基层推广运用。(2)常规的分离培养法，依赖于专业操作人员的显微镜形态判断，容易造成误判，此类方法的培养时间长达18-24个小时，也不适用于无乳链球菌的快速检测。

发明内容

为了解决前述问题，本发明提供了一种新的无乳链球菌单克隆抗体及其制备方法。

本发明首先提供了一种产生无乳链球菌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，它是由中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏的保藏号：CCTCC NO：C2015178的细胞株。

本发明表达单抗NC7b的细胞株(杂交瘤细胞株TWDB-WR-1)，于2015年10月21日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其地址为：中国.武汉.武汉大学，其保藏号为：CCTCC NO：C2015178。

本发明提供了前述杂交瘤细胞株的方法，它包括如下步骤：

(1)以氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示重组蛋白为抗原，接种BALB/c小鼠，分离小鼠脾细胞；

(2)取小鼠脾细胞，与骨髓细胞融合，筛选，即可。

本发明提供了一种无乳链球菌单克隆抗体，它是由前述细胞株分泌的单克隆抗体。

本发明提供了前述单克隆抗体的方法，它包括如下步骤：

1)取前述杂交瘤细胞株，注射入BALB/c小鼠腹水中增殖；

2)收集腹水，使用Protein G Sepharose亲和层析柱纯化，即可。

本发明提供了前述无乳链球菌单克隆抗体在检测无乳链球菌中的用途。

本发明提供了前述无乳链球菌单克隆抗体在制备检测无乳链球菌的试剂中的用途。

本发明提供了前述无乳链球菌单克隆抗体在制备检测无乳链球菌的胶体金快速检测试纸中的用途。

优选地，待检样本为养殖水体或者鱼体。

本发明还提供了SEQ ID NO.1所示重组蛋白。

采用本发明制备得到了无乳链球菌Sip单抗NC7b，其本身的特异性强，仅与无乳链球菌结合，而与其他细菌无交叉反应，滴度高，结合能力强，采用该蛋白制备的无乳链球菌检测试纸灵敏度高、特异性强、重复性好，能准确检测实际样品，可以有效解决现有无乳链球菌检测存在复杂、不准确的问题，应用前景良好。

在本抗体制备的试纸成功研制之前，国际上尚无针对无乳链球菌的快速检测试纸的报道。从已有文献来看，研制该试纸所需要的生物材料非常难以制备和获取。因此，成功研制由本抗体制备的试纸在世界上尚属首次，处于世界领先水平。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1本发明单抗的纯化结果；

图2水产常见细菌免疫印迹结果。1-A第一抗体：NC7b；1-B第一抗体：CE12；

图3试纸的结构，1：PVC底板；2：硝酸纤维素膜；3：胶体金垫；4：吸水垫；5：检测线；6：质控线；7：样品垫；