[发明专利]一种直接对miRNA进行绝对定量检测的方法

说明书

本发明公开了一种直接对miRNA进行绝对定量检测的方法，属于分子生物学领域，采用miRFLP测定法，其步骤包括：待测样本与动态miRNA标准混合均匀，经过miRNA逆转录、cDNA加尾、PCR同步扩增及PCR扩增产物的荧光片段长度多态性分析，在所述cDNA加尾步骤中，对适配寡聚核苷酸链3’末端进行修饰，降低反应背景信号，避免miRNA3’末端同源序列的干扰；采用生物素‑琼脂糖链霉素偶联试剂或链霉素磁珠富集逆转录及PCR反应物，增加上样量，减低方法误差，加入细菌RNA作为保护试剂，降低测定误差，本方法可以对0.4μl的样本进行直接测定，在128个分子的测定水平，测定变动范围降低至9.9％，本方法测定的灵敏度显著提高，测定误差范围显著缩小。

技术领域

本发明涉及一种血浆miRNA定量检测的方法，尤其涉及一种直接对血浆miR-122进行绝对定量检测的方法。

背景技术

成熟miRNA是一类由22个碱基(nt)组成的、具有调控基因表达作用的单链小分子核糖核酸，镶嵌于4种Argonaute(Ago)之一的蛋白质中，形成RNA介导的基因沉默复合体(RISC)。RISC在mRNA上滑动，当在mRNA的3’端非翻译区(3’-UTR)区域遇上与miRNA互补的靶序列时，就会抑制利用该mRNA进行的蛋白质生产。miRNA是现今发现的唯一一类通过与被调控的靶基因3’-UTR碱基序列配对而发挥调控作用的调控因子，使miRNA与被调控的靶基因之间建立起独特的1对1或1对多的特异性，影响并参与维持细胞的生理状态和分化程度。通过对细胞的影响，特定miRNA表达量的变化影响并维持组织的特征，反映生物个体的生理病理特征，预示其作为鉴定多种疾病的生物标记的可能性。例如脊椎动物都拥有的、进化保守的miR-122，只在肝细胞中富集，每个肝细胞中所含拷贝数可达5万之多。不论何种原因导致肝细胞的损坏时，miR-122被释放，经血液带至全身，血液中的miR-122水平变化就可以揭示肝脏受损的情形。血液中富含RNA降解酶，因此游离RNA分子在血液中的存活期仅为几分钟，而成熟miRNA分子受蛋白质复合体的保护而不被降解。事实上，室温下放置24小时或10次以内反复冻融处理对血清miRNA浓度没有影响。血液，也包括其它体液，如脑脊液、尿液、泪液等含有的miRNA，都具有这样的特质，使其成为最具潜力的无创诊断生物标记物。

大量的文献报道，都证实血清miR-122水平升高可以专一地揭示肝细胞的实时损伤。肝细胞含有多达5万个miR-122(Bissels,2009)，肝脏一旦受到损害，受损肝细胞的miRNA释放到血液，引起血液miRNA水平的改变。健康人血液中miR-122的含量维持在每微升300个拷贝数左右。以成人4升血液计算，约100个肝细胞受损释放进入血液的miR-122可以使每微升血液miR-122的水平升高1.25个拷贝数，对应每微升血浆为2.5个拷贝。miRNA在血液中的半衰期小于24小时，因此血液中miR-122拷贝数的改变可以实时而专一地反映肝损害的程度。因此血液miR-122绝对分子数目的定量测定对于肝细胞损伤程度的实时研判具有特殊的意义，目前尚缺乏健康人血清miR-122浓度的基础值数据，和具有实用价值的miRNA客观测定方法。

目前应用的miRNA定量测定技术主要有：逆转录实时定量PCR(RT-qPCR)、RNA-seq深度测序法、microArray杂交测定法、NanoString nCounter及纳米微孔测序法。这些测定方法有一些共同点，如：需要纯化的RNA、灵敏度低、内源性标准、数据校准等，测定结果为miRNA含量相对倍数，而非拷贝数。除了RT-qPCR法，其余方法均有测定灵敏度低的缺陷，如其中最灵敏的NanoString nCounter法的测定低限为1amol或6x10^5个分子以上的水平，而miR-seq和microArray的测定低限更高，0.1fmol分子以上，不满足临床诊断的需要。循环miRNA表达量的巨大变动，加上miRNA拥有超短的长度、相似的序列、二级构象、末端修饰、含有相同序列的前体及长度差异性等特性，给目前miRNA定量测定技术的客观性带来很大的挑战。