[发明专利]中华绒螯蟹微孢子虫的原位杂交检测探针及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及中华绒螯蟹微孢子虫的原位杂交检测探针及检测用试剂盒。

背景技术

中华绒螯蟹(Eriocheirsinensis)俗称河蟹，是我国特有的水产养殖珍品，但随着养殖集约化和规模化发展，各种病害已经成为危害养蟹业的重要难题。近几年，在江苏省兴化市、盐城市盐都区和泗洪县等地的河蟹主养区广泛流行微孢子病，该疫情给当地的河蟹养殖产业造成了巨大损失。主要症状为河蟹附肢长期空瘪，虽能继续蜕壳，但生长缓慢，解剖见肝胰脏颜色由金黄色逐渐变浅，直至灰白色，部分还出现“拉黄”(排泄肝胰腺)的症状。至今为止，关于该病的诊断仍然是主要采用解剖观察的方法，具有明显的局限性，因此开发出更加高效、准确和便捷的诊断方法将有非常显著的现实意义和广阔的应用前景。

原位杂交技术是利用带有标记物的特征性核酸序列作为探针，与样品中互补的核酸序列杂交，然后通过抗原-抗体反应和酶-底物的化学显色反应将检测信号逐级扩大，显示检测结果。原位杂交假阳性率低，从直观性、准确性和灵敏度综合考虑是一种其它任何方法都无法替代的检测方法，且至今未见有关中华绒螯蟹微孢子虫的原位杂交检测方法的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于高灵敏度、高可信度同时又非常直观的中华绒螯蟹微孢子虫检测的探针，并提供检测试剂盒。

本发明根据中华绒螯蟹微孢子虫18SSSUrDNA(HE584635)设计一对特异性引物，PCR扩增，以地高辛进行标记，制备特异性检测中华绒螯蟹微孢子虫的探针，所述探针如SEQIDNO.1所示，该探针的引物序列如SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示。

本发明公开了中华绒螯蟹微孢子虫的原位杂交检测探针，序列如SEQIDNO.1所示。该序列以地高辛进行标记可制备成检测中华绒螯蟹微孢子虫的特异性探针，用于检测试剂盒中。

本发明还公开了SEQIDNO.1所示序列作为中华绒螯蟹微孢子虫的原位杂交检测探针的应用。

本发明公开了上述中华绒螯蟹微孢子虫的原位杂交检测探针在制备中华绒螯蟹微孢子虫的原位杂交检测试剂盒中的应用。

此外，本发明还提供一种用于中华绒螯蟹微孢子虫的原位杂交检测试剂盒，该试剂盒包括原位杂交检测试剂，还含有由上述中华绒螯蟹微孢子虫的原位杂交检测探针制备的特异性探针。具体地，该试剂盒由多个试剂瓶组成，所述的试剂瓶包括含特异性探针A液(探针浓度100μg/ml)，所述特异性探针是指经地高辛进行标记的SEQIDNO.1，含蛋白酶K(10μg/ml)的B液，用于促进探针结合的C液(DigEasyHybGranules,Roche)，封闭非特异性蛋白位点的D液(10×，Blockingsolution，Roche)，含有碱性磷酸酶标记地高辛抗体的E液，用于显色的F液(50×NBT/BCIP)。

本发明具有如下有益效果：

(1)能直观地将微孢子虫与其引起的病理变化结合起来；

(2)在高效、准确检测微孢子虫的同时可根据样本切片分析感染率和感染强度；

(3)由于探针的杂交是特异的，且信号经过了逐级放大，所以较常规的染色检测灵敏、精确；

(4)本发明中，显色后的切片可以长期保存。

附图说明

图1，健康中华绒螯蟹阴性对照；

图2，轻度微孢子虫感染的中华绒螯蟹原位杂交检测结果；

图3，重度微孢子虫感染的中华绒螯蟹原位杂交检测结果。

图中标尺＝100μm。

具体实施方式

下列实验及操作实例是进一步对本发明的说明，不应该当作对本发明的限制。以下实施例中除特别说明外，均为本领域内的常规试剂、实验方法和操作步骤。

实施例1：

中华绒螯蟹样品：

发病中华绒螯蟹于2014年8月取自江苏省内发生严重死亡的养殖场，平均重量91.2g(样本量n＝30)。健康中华绒螯蟹于2014年9月，取自南京中华绒螯蟹养殖场，平均重量94.3g(样本量n＝24)。健康中华绒螯蟹通过常规光镜、电镜观察和PCR检测，确定无微孢子虫感染，作为阴性对照；发病中华绒螯蟹经光镜、电镜观察和PCR检测确定是有微孢子虫感染后，作为阳性对照。

样品固定及切片制备：