[发明专利]硫代缩酮连接单元的合成及其在DNA测序中的用途

权利要求书

1.一种氧化敏感硫代缩酮连接单元在非诊断和治疗目的的DNA测序中的用途，其特征在于，所述氧化敏感硫代缩酮连接单元的结构式如式(Ⅰ)所示：其中，R＝OH或者COOH；R₁＝R₂＝甲基，或R₁＝苯基、对甲氧基苯基、2,4,6-三甲氧基苯基、萘基或对甲氧基萘基，R₂＝H，或R₁、R₂共同构成环己基、环戊基；

所述氧化敏感硫代缩酮连接单元与核苷酸及荧光素连接得到可逆终止剂，所述可逆终止剂可用于DNA合成测序。

2.根据权利要求1所述的氧化敏感硫代缩酮连接单元在非诊断和治疗目的的DNA测序中的用途，其特征在于，所述氧化敏感硫代缩酮连接单元的合成方法包括如下步骤：

S1、三氟乙酸乙酯与2-巯基乙醇盐酸盐在三乙胺作用下反应，得到2-巯基三氟乙酰胺；

S2、丙酮、环戊酮、环己酮、苯甲醛、对甲氧基苯甲醛、1,4,6-三甲氧基苯甲醛、萘醛或对甲氧基萘醛，与所述2-巯基三氟乙酰胺以及3-巯基丙酸甲酯反应，得到硫代缩酮化合物

S3、硫代缩酮化合物在PBS缓冲溶液中，将甲酯转化为硫代缩酮羧酸化合物

S4、硫代缩酮羧酸化合物进一步去掉氨基的保护基，即得所述氧化敏感硫代缩酮连接单元

3.根据权利要求1所述的氧化敏感硫代缩酮连接单元在非诊断和治疗目的的DNA测序中的用途，其特征在于，所述氧化敏感硫代缩酮连接单元的合成方法包括如下步骤：

B1、三氟乙酸乙酯与2-巯基乙醇盐酸盐在三乙胺作用下反应，得到2-巯基三氟乙酰胺；

B2、丙酮、环戊酮、环己酮、苯甲醛、对甲氧基苯甲醛、1,4,6-三甲氧基苯甲醛、萘醛或对甲氧基萘醛，与所述2-巯基三氟乙酰胺以及含羟基保护基的2-巯基乙醇反应，得到硫代缩酮化合物

B3、硫代缩酮化合物在弱酸性溶液中，去羟基保护基，得化合物A

B4、化合物A进一步去掉氨基的保护基，即得所述氧化敏感硫代缩酮连接单元

4.一种可逆终止剂，其特征在于，所述可逆终止剂由如权利要求1所述的氧化敏感硫代缩酮连接单元与核苷酸及荧光素连接而得。

5.根据权利要求4所述的可逆终止剂，其特征在于，所述氧化敏感硫代缩酮连接单元与核苷酸及荧光素的连接包括如下步骤：

A1、以无水DMF为溶剂，在TEA存在的条件下，所述氧化敏感硫代缩酮连接单元与TAMRA(5/6)反应，得化合物G

A2、在TEA存在的条件下，化合物G和DSC反应，得到中间体H该中间体H不需要分离纯化直接与dUTP(AP3)反应，得到化合物II即所述可逆终止剂。

6.根据权利要求5所述的可逆终止剂，其特征在于，步骤A1中，所述TAMRA(5/6)、酸敏感连接单元和TEA的摩尔比为1：(1～3)：(3～10)。

7.根据权利要求5所述的可逆终止剂，其特征在于，步骤A2中，所述化合物G、DSC、TEA和dUTP(AP3)的摩尔比为1：(5～12)：(6～15)：(2～4)。