[发明专利]一种用于黄曲霉毒素B1富集净化的免疫磁珠及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及黄曲霉毒素B1样本的富集净化处理工艺，具体涉及一种用于黄曲霉毒素B1富集净化的免疫磁珠及其制备方法和应用。

背景技术

黄曲霉毒素B1(AflatoxinB1简写为AFB1)是二氢呋喃氧杂萘邻酮的衍生物，含有一个双呋喃环和一个氧杂萘邻酮(香豆素)。黄曲霉毒素B1是已知的化学物质中致癌性最强的一种。黄曲霉毒素B1对包括人和若干动物具有强烈的毒性，其毒性作用主要是对肝脏的损害。在天然食物中以黄曲霉毒素B1最为多见，危害性也最强，国家质检总局规定黄曲霉毒素B1是大部分食品的必检项目之一。中国食品卫生标准中规定了几种主要易受污染的食物中黄曲霉毒素B1的允许量标准，玉米、花生、花生油中黄曲霉毒素B1允许量为≤20μg/kg；其他食用油为≤10μg/kg；其他粮食、豆类、发酵食品为≤5μg/kg。

目前食品中黄曲霉毒素B1的主要提取方法包括有机溶剂萃取法、免疫亲和层析法等。有机溶剂萃取法是目前最普遍的提取方法，但有机溶剂的萃取存在过程复杂、毒性大、所需时间长等缺点，而且由于最终提取物中可能存在其他荧光物质、色素、结构类似物，从而对检测结果产生干扰；免疫亲和层析提高了试样的净化效果，同时可显著减少有毒有害试剂的使用，但样品前处理较复杂，所用设备价格昂贵，对操作人员的技术要求也比较高，不适合于大批量样本检测及大范围推广的应用。

免疫磁珠分离技术(Immunomagneticbead-basedseparation，IMS)是近年来发展起来的一项新的免疫学技术。免疫磁珠(Immunomagneticbead，IMB)既可结合活性蛋白质抗体，又可被磁铁吸引，经过处理后，可将抗体结合在磁珠上，使之成为抗体的载体，磁珠上抗体与特异性抗原物质结合后，则形成抗原-抗体-磁珠免疫复合物，这种复合物在磁力作用下发生力学移动，使复合物与其它物质分离，而达到分离特异性抗原的目的。免疫磁珠(IMB)是一个平台，凡是利用抗原抗体结合原理进行工作的领域都可以应用，并且已在医学和生物学的骨髓移植、分离干细胞、细胞器、癌细胞、激素、病原菌以及毒素等方面取得了显著成绩。近年来IMB以其高度的敏感性和特异性被广泛应用于食品、水、生物样品、环境等标本中真菌毒素的分离和检测工作中，显示出良好的开发应用前景。

在分离真菌毒素方面，IMB可有效地收集、浓缩大量样品中的少量真菌毒素，可避免有机溶剂萃取法、免疫亲和层析法提取时存在的缺点。IMB对目的毒素的富集具有高分离率、高特异性、高稳定性、无污染、无毒性、操作简便、样品用量少且不会破坏毒素结构等优点，与常规方法相比，不需要多加纯化步骤去除杂质，可直接对真菌毒素产生富集分离纯化的效果，并可在2-5h内完成。并且磁珠上偶联的抗体可准确识别真菌毒素上的特征基团，从而减少漏检，减少安全隐患。

本发明利用磁珠与抗体的偶联原理对可富集黄曲霉毒素B1的免疫磁珠的制备工艺及应用条件进行了优化，大大提高了对黄曲霉毒素B1的富集能力和检测灵敏度，同时凭借免疫磁珠自身的快速方便、价格低廉的特点，将其应用于谷物及饲料中黄曲霉毒素B1的分离与富集，可以进一步提高快速检测黄曲霉毒素B1的效率。

发明内容

本发明的目的是为了弥补现有技术存在的不足，提供一种用于黄曲霉毒素B1富集净化的免疫磁珠及其制备方法和应用，以解决黄曲霉毒素B1样品净化分离操作复杂、分离效率低、存在较大安全隐患的技术问题。

为实现上述发明目的，本发明采取的技术方案是：提供一种用于黄曲霉毒素B1富集净化的免疫磁珠，所述免疫磁珠上偶联有黄曲霉毒素B1单克隆抗体；所述黄曲霉毒素B1单克隆抗体是用黄曲霉毒素B1人工抗原免疫白鼠所得到的；所述黄曲霉毒素B1人工抗原是黄曲霉毒素B1半抗原与载体蛋白的偶联物，其分子结构式如式Ⅰ所示：

所述黄曲霉毒素B1半抗原是按照如下方法制备得到的：

62mg黄曲霉毒素B1溶于1mL二甲基亚砜(DMSO)，60℃下缓慢滴加入25mg对苯二胺和0.1mL吡啶在1mLDMSO的混合液中，滴加完毕后，继续反应15h，旋蒸除去溶剂，柱层析纯化后得到黄曲霉毒素B1的对苯二胺单缩合物，得到黄曲霉毒素B1半抗原，得率90％。

所述黄曲霉毒素B1人工抗原是按照如下方法制备得到的：