[发明专利]一种用于黄曲霉毒素B1富集净化的免疫磁珠及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种用于黄曲霉毒素B1富集净化的免疫磁珠，其特征在于：所述免疫磁珠上偶联有黄曲霉毒素B1单克隆抗体；所述黄曲霉毒素B1单克隆抗体是用黄曲霉毒素B1人工抗原免疫白鼠所得到的；所述黄曲霉毒素B1人工抗原是黄曲霉毒素B1半抗原与载体蛋白的偶联物，其分子结构式如式Ⅰ所示：

2.根据权利要求1所述的免疫磁珠，其特征在于：所述黄曲霉毒素B1人工抗原是按照如下方法制备得到的：

取半抗原9.4mg，用2mL0.1mol/LHCl溶解，得到溶液A；取亚硝酸钠20mg用1mL水溶解，逐滴加入到溶液A中；用碘化钾试纸检测，室温搅拌反应30min；取50mgBSA，用4mL水溶解，得到溶液B；将溶液A缓慢加入到溶液B中，室温搅拌反应过夜；用0.02mol/L的PBS透析三天，每天更换透析液三次，得到黄曲霉毒素B1人工抗原。

所述黄曲霉毒素B1半抗原的分子结构式如式Ⅱ所示：

3.根据权利要求1或2所述的免疫磁珠，其特征在于：所述黄曲霉毒素B1半抗原是按照如下方法制备得到的：62mg黄曲霉毒素B1溶于1mL二甲基亚砜(DMSO)，60℃下缓慢滴加入25mg对苯二胺和0.1mL吡啶在1mLDMSO的混合液中，滴加完毕后，继续反应15h，旋蒸除去溶剂，柱层析纯化后得到黄曲霉毒素B1的对苯二胺单缩合物，得到黄曲霉毒素B1半抗原，得率90％。

4.一种权利要求1所述免疫磁珠的制备方法，其特征在于：以粒径2.8μm的羧基磁珠为载体，羧基磁珠末端具有反应活性的羧基基团，在经活化剂EDC-NHS组合处理后，活化磁珠可与黄曲霉毒素B1单克隆抗体进行偶联，制备成能够富集净化黄曲霉毒素B1的免疫磁珠。

5.根据权利要求4所述免疫磁珠的制备方法，其特征在于：具体包括如下步骤：

(1)清洗：取100μL羧基磁珠于离心管中，用100μL含0.05％吐温-20的pH5.0、25mmol/L的MES溶液洗涤2次，磁分离后移除上清；

(2)活化：用4℃贮存的pH5.0、25mmol/LMES溶液分别配制50mmol/L的EDC、NHS溶液；分别加入50μL新配制的EDC和NHS溶液到装有磁珠的离心管中，涡旋混匀，室温活化30min，磁分离后移除上清，同(1)MES溶液洗涤2-3次；

(3)偶联：将黄曲霉毒素B1单克隆抗体溶解到60μLpH5.0、25mmol/LMES溶液中，用所述MES溶液调节总体积至100μL，轻柔加入到已活化磁珠中，室温偶联30min或4℃偶联2h，期间使磁珠保持混匀状态；

(4)封闭：磁分离后移除上清，加入100μLpH7.4的TRIS溶液反应15min封闭磁珠；

(5)保存：磁分离后移除上清，用100μL含0.1％-0.3％牛血清白蛋白、0.1％吐温-20的TRIS溶液洗涤封闭好的磁珠3-5次，磁分离后移除上清，将磁珠复溶于含0.1％-0.5％牛血清白蛋白、0.01％-0.1％吐温-20、0.02％NaN₃的TRIS溶液中，2-8℃保存备用。

6.权利要求1所述免疫磁珠在富集净化黄曲霉毒素B1中的应用。