[发明专利]具核梭杆菌灭活疫苗和制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及疫苗技术领域，具体涉及具核梭杆菌灭活疫苗的制备方法及其疫苗。

背景技术

具核梭杆菌(Fusobacteriumnuleatum，Fn)是革兰氏专性厌氧杆菌，广泛存在于人体及多种动物体内的无芽胞厌氧菌属。典型的具核梭杆菌外观呈纺锤形，有锐利的尖端，偶尔中间膨胀。过去一直把该菌视为人体的正常菌群之一，近年来，由于从临床标本中不断分离出该菌，具核梭杆菌引起国内外学者的关注，被视为临床上不可忽视的细菌。大量研究证实该菌为条件致病菌，且具有较强的致病力，在口腔乃至全身感染性疾病中检出率极高，广泛存在于感染的牙髓、牙周和其他炎症性病灶中。作为优势菌种，具核梭杆菌与临床厌氧菌感染的关系十分密切，并与结肠癌等消化道肿瘤发病相关。经过检索发现，具核梭杆菌的疫苗尚未制备，通过本文所述的制备方法将可以弥补这个空白。

发明内容

本发明的目的在于提供一种安全有效，工艺简单，生产成本低的具核梭杆菌灭活疫苗的制备方法。

本发明提供的这种具核梭杆菌灭活疫苗的制备方法包括以下步骤：具核梭杆菌的分离和培养；收集；灭活；乳化制剂；无活菌检测；抗体效价检验。

a、通过购买的标准株或者从临床分离得到的细菌株经过连续传代接种于适宜平板上，分离鉴定得到菌种后；

b、将菌种通过适宜平板上增殖细菌，用PBS稀释液洗涤，或者将菌种接种于含适宜培养基的厌氧瓶中增殖细菌，通过离心培养基收集细菌，直至最终菌液浓度达到本行业标准。如果上述最终菌液低于本行业标准可进行浓缩直至最终菌液达到本行业标准；

c、菌体灭活；

d、将灭活菌体加入佐剂，通过物理混合方法制备成疫苗；

e、将步骤d制备的灭活疫苗进行细菌培养，结果为无菌生长，即可判定疫苗合格：

f、将步骤e判定合格的灭活疫苗接种于小白鼠，设置实验组和对照组，用步骤d制备的疫苗进行接种，接种疗程结束后可进行取血检测抗体效价。

本发明的有益效果：

a、本发明的制备工艺简单，通过制备得到了具核梭杆菌灭活疫苗，弥补了当前的空白，有长期的健康保障作用。

b、本方法制备得到的灭活疫苗的免疫原性很强，抗体效价很高。

附图说明

图1示出了具核梭杆菌疫苗的一种免疫方法。

图2示出了具核梭杆菌疫苗免疫小鼠后，小鼠血清中抗体滴度变化。

具体实施方式

以下结合具体实施例，进一步阐明本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1：具核梭杆菌的增殖培养

将具核梭杆菌ATCC25586复苏后连续3次传代接种于厌氧血平板上，挑取菌落进行革兰染色镜检观察其形态及染色性初步验证菌株，通过对菌落进行脱氧核糖核酸提取后进行PCR鉴定和全基因测序进行菌株的最终验证。经鉴定正确的菌种接种于含有BHI培养基的厌氧瓶，待细菌增值到一定量后，将培养基离心获得细菌，按照部颁标准进行培养物细菌总数测定。

实施例2：具核梭杆菌的灭活

取含菌量10¹⁰CFU/ml以上的具核梭杆菌培养液经过离心测到菌体沉淀后用生理盐水洗涤细菌3-4次，用PBS重悬细菌，加入福尔马林(终含量为1％)，置于30-40℃灭活16-30小时，取灭活菌种接种于BHI培养基分别在无氧和有氧条件下培养48小时，均无细菌生长方视为合格。

实施例3：具核梭杆菌疫苗的制备

取灭菌液与弗氏完全佐剂比例为1∶1制备初次和末次接种疫苗；取灭菌液与弗氏不完全佐剂比例为1∶1制备中间接种疫苗。乳化方法为取细菌佐剂混合物用注射器乳化法经抽提60次乳化完成。

实施例4：抗体效价检测

疫苗制备成功后，选取30只8周龄昆明鼠通过皮下注射进行疫苗接种，注射剂量为100μl，每隔2周免疫一次，总共免疫4次，初次免疫后每隔两周进行小鼠尾静脉取血，通过离心获取小鼠血清进行ELISA夹心检测法测定抗体效价。免疫过程如图1所示。4次免疫完成后小鼠血清抗体效价在3万以上，抗体滴度变化图如图2所示。

实施例5：具核梭杆菌攻毒实验

选用20只前期实验中进行疫苗免疫的小鼠，在末次免疫后14天，提前24小时断食、断水，灌喂具核梭杆菌菌液(2×10⁸cfu/ml)，每只灌喂0.5ml，上下午各一次，间隔6小时，末次灌喂后2小时进食。