[发明专利]一种金毛狗绿色球状体途径的组培繁殖方法

说明书

技术领域

本发明属植物组织培养技术领域，具体涉及金毛狗绿色球状体诱导和增殖方法。

技术背景

金毛狗(Cibotiumbarometz)，隶属于蚌壳蕨科金毛狗属，根状茎平卧、粗大，端部上翘，露出地面部分密被金黄色长茸毛，状似伏地的金毛狗，形态独特，具观赏价值，金色茸毛可入药，被收入《中华人民共和国药典》。《国家重点保护野生植物名录(第一批)》将蚌壳蕨科的所有种均列为国家级Ⅱ重点保护野生植物，中国大陆地区蚌壳蕨科仅1属1种，即：金毛狗属的金毛狗。

自然条件下，金毛狗采用孢子进行繁殖，但孢子萌发和配子体发育对环境条件的要求较为严格，导致其自然繁殖能力极低，加之环境破坏和人为采掘，金毛狗的野生种群数量急剧减少，濒临灭绝。

目前，金毛狗的组织培养多限于孢子繁殖途径，其方法主要包括：孢子萌发培养、原叶体培养、孢子体培养、生根培养等步骤，存在繁殖周期长、孢子体诱导率低等缺陷，因此，寻找一种繁殖周期短同时繁育效率高的方法，对于珍稀濒危蕨类—金毛狗种群数量的扩大，以及濒危程度的缓解具有重要意义。

蕨类植物绿色球状体是指由蕨类植物外植体诱导得到的由众多绿色颗粒组成的球状体，其本质是分生组织集合体，接种于分化培养基上可以获得大量蕨类植物幼苗，一旦诱导得到绿色球状体，其繁殖系数将显著高于孢子繁殖途径，且繁殖周期缩短。

由于外植体选择以及适宜的植物激素筛选方面的原因，目前，已经成功诱导绿色球状体的种类较为有限，且在绿色球状体增殖过程中，只有选择适宜的植物激素配方和培养方式，才能在抑制绿色球状体分化的同时实现快速增殖。因此，目前，尚无珍稀濒危蕨类金毛狗通过绿色球状体途径组培繁殖研究的相关报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服金毛狗自然繁殖力低、通过孢子繁殖途径组培繁殖周期较长，且繁殖系数较低等技术问题。

为解决上述技术问题，本发明提供一种金毛狗绿色球状体途径的组培繁殖方法，该方法包括以下步骤：

(1)金毛狗无菌外植体的获得

将金毛狗无菌孢子接种在1/4MS+蔗糖30.0g/L+琼脂7.0g/L，pH为5.80的培养基上，培养条件为：20～25℃、每天的光照时间为12小时，光照强度为2000lx，得到无菌苗，在超净工作台，将无菌苗在解剖镜下用镊子剥离出茎尖，将茎尖作为金毛狗绿色球状体诱导的无菌外植体；

(2)金毛狗绿色球状体的诱导

①第一次诱导预培养：将步骤(1)获得的茎尖接种于绿色球状体诱导预培养基Ⅰ，培养5天～7天，培养条件与步骤(1)相同，所述绿色球状体诱导预培养基Ⅰ为：1/4MS～1/2MS+6-BA1.0～1.5mg/L+NAA0.2～0.4mg/L++蔗糖30.0g/L+琼脂7.0g/L，pH为5.80；

②第二次诱导预培养：将步骤(2)①第一次诱导预培养后的茎尖接种于绿色球状体诱导预培养基Ⅱ，培养时间为5天～7天，培养条件与步骤(1)相同，所述绿色球状体诱导预培养基Ⅱ为：1/4MS～1/2MS+2-ip0.1～0.3mg/L+NAA0.2～0.4mg/L+蔗糖30.0g/L+琼脂7.0g/L，pH为5.80；

③绿色球状体的诱导：将步骤(2)②第二次诱导预培养后的茎尖接种于绿色球状体诱导培养基，培养条件与步骤(1)相同，培养时间为14天～20天，得到绿色球状体，所述绿色球状体诱导培养基为：1/4MS～1/2MS+TDZ0.6～0.8mg/L+NAA0.2～0.4mg/L+蔗糖30.0g/L+琼脂7.0g/L，pH为5.80；

(3)金毛狗绿色球状体的增殖

每一个增殖周期按以下顺序进行：

①第一步增殖培养：将步骤(2)③获得的绿色球状体切割成1～3mm，接种于增殖培养基A，培养18天～21天，培养条件与步骤(1)相同，所述增殖培养基A为：1/4MS～1/2MS+TDZ0.8～1.2mg/L+NAA0.1～0.2mg/L+蔗糖30.0g/L+琼脂7.0g/L，pH为5.80；

②第二步增殖培养：将(3)①第一步增殖培养增殖后的绿色球状体接种于增殖培养基B，培养18天～21天，培养条件与步骤(1)相同，所述增殖培养基B为：1/4MS～1/2MS+2-ip0.1～0.2mg/L+6-BA1.0～1.2mg/L+NAA0.05～0.1mg/L+蔗糖30.0g/L+琼脂7.0g/L，pH为5.80；

(4)金毛狗绿色球状体的分化