[发明专利]龙葵金属硫蛋白表面展示工程菌的构建方法及用途

权利要求书

1.一种龙葵金属硫蛋白表面展示工程菌的构建方法，其特征在于提取龙葵金属硫蛋白基因，以pYES2为出发载体，将载体上的诱导型启动子替换为组成型表达启动子，将酿酒酵母的分泌信号肽基因连在组成型启动子之后，将酿酒酵母锚定蛋白凝集素基因的3’端序列连在启动子之后，将获得的龙葵金属硫蛋白基因连在分泌信号肽基因和凝集素基因之间，将构建好的表达载体转入大肠杆菌扩增得组成型表达表面展示载体，提取载体质粒，转入酿酒酵母。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于提取龙葵金属硫蛋白基因包括以下步骤：

（1）提取龙葵的RNA，

（2）通过反转录得到龙葵的cDNA，

（3）以cDNA为模板，通过PCR的方法扩增出龙葵的金属硫蛋白基因，

（4）琼脂糖凝胶电泳，切胶回收，连接T载体，转化大肠杆菌，

（5）挑选阳性克隆，培养，菌液PCR，测序确定，

（6）质粒提取，

（7）酶切获得带酶切位点的龙葵金属硫蛋白基因片段。

3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于构建表达载体操作如下：

（1）以酿酒酵母穿梭表达载体pYES2为出发载体，将pYES2上的诱导型启动子GAL1替换为酿酒酵母组成型强启动子，丙糖磷酸异构酶启动子TPI，得到组成型表达载体pYES2-Tpi；

（2）以质粒pPIC9K为模板，以带有MfeⅠ和SpeⅠ酶切位点的酵母分泌信号肽基因alphafactor扩增引物Alphafactor-Forward和Alphafactor-Reverse，PCR扩增出酵母分泌信号肽基因alphafactor，用MfeⅠ和SpeⅠ酶切消化获取的分泌信号肽段alphafactor，连接到经过EcoRⅠ和XbaⅠ酶切消化的酿酒酵母组成型表达载体pYES2-Tpi上，得到重组质粒pYES2-Tpi-alpha；

（3）以酿酒酵母基因组DNA为模板，以带有EcoRⅠ和NotⅠ酶切位点的酿酒酵母锚定序列凝集素3’端序列AG扩增引物AGα1-Forward和AGα1-Reverse，进行PCR扩增，用EcoRⅠ和NotⅠ酶切消化获取的锚定序列凝集素3’端序列AG，连接到同样经过EcoRⅠ和NotⅠ酶切消化的pYES2-Tpi-alpha上，经菌落PCR筛选和测序分析得重组质粒pYES2-Tpi-alpha-AG；

（4）将龙葵金属硫蛋白基因，连接到经EcoRI和MluI消化的重组质粒pYES2-Tpi-alpha-AG上；

上述操作中用到的引物序列如下：

Primer IDSequenceRestriction SiteTPI-ForwardGCACTAGTATATGACAGAGTCGC SpeⅠTPI-ReverseCGAATTCCTGTATGTGTTTTTTG EcoRⅠAlpha factor-ForwardTCCAATTGATGAGATTTCCTTC MfeⅠAlpha factor-ReverseGAACTAGTTCGCGGCCGCCCTA SpeⅠ、NotⅠAGα1-ForwardGGAATTCCTCTAGACGCGTCGCCAAAAGC EcoRⅠ、MluⅠAGα1-ReverseGCGTGCGGCCGCTTTGATTATGTTCTTTCTAT NotⅠ

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