[发明专利]龙葵金属硫蛋白表面展示工程菌的构建方法及用途

说明书

技术领域

本发明涉及工程菌株构建技术领域，特别涉及一种龙葵金属硫蛋白表面展示工程菌的构建方法，还涉及龙葵金属硫蛋白表面展示工程菌的用途。

背景技术

随着工业的飞速发展，各种重金属离子通过各种工业途径释放到环境中。由于重金属具有强毒性，不可降解性和食物链富集性，因此重金属的环境污染问题得到越来越多的重视(NriaguandPacyna1988；DhankharandHooda2011)。而且，摄入过量的重金属会对人的健康造成各种各样的危害(Wuetal.2004；Batayneh2012)。许多处理重金属的方法，例如离子转换，物理渗透，化学沉淀，活性炭吸附，电凝固，电渗析，超过率和溶剂萃取等多种方法被很多的人研究(Holanetal.1993；Ariefetal.2008)。但是，通常的物理和化学方法有成本高，去除不彻底，二次污染和专一性不强等缺点(Davisetal.2003；Dabrowskietal.2004；AkbalandCamci2012)。更多的科学家转向生物吸附剂的研究。(Hammainietal.2002；KurodaandUeda2003,2006；Ariefetal.2008；KotrbaandRuml2010；Kurodaetal.2012；Parisuthametal.2014；TanakaandKondo2015)。

镉是一种被工业广泛应用，但对人健康又有危害的一种重金属(Pirzadeh,etal.2012)。由于它有通过生物链富集的特性，因此，人们经常通过食物间接的摄入过量的镉而造成对身体健康的危害(Alexanderetal.2009)。为了去除环境中的镉污染，科学家做了很多的研究。(GaddandWhite1993；TanakaandKondo2015)。利用微生物，特别是表面展示工程菌作为吸附剂，来去除镉污染，也许会成为一种有效可行的方法。

发明内容

为了解决以上现有技术中去除环境中重金属常用的物理和化学方法成本高、去除不彻底、二次污染和专一性不强等缺点，本发明提供了一种利用微生物，可以吸附镉的龙葵金属硫蛋白表面展示工程菌的构建方法。

本发明还提供了龙葵金属硫蛋白表面展示工程菌的用途。

龙葵是一种镉超富集植物，这一特征与它的金属硫蛋白有着密切的关系(Ferrazetal.2012)。但是，至今还没有人将龙葵的金属硫蛋白展示在酿酒酵母表面，来构建镉吸附工程菌。为了提高酿酒酵母对镉的吸附能力和耐受能力，我们首次将龙葵的一种金属硫蛋白，通过表面展示技术成功的展示在了酿酒酵母的表面。成功的构建出了一种高效吸附重金属镉的工程菌，对其吸附性能研究表明，在镉污染处理领域有广阔的应用前景。

本发明是通过以下步骤得到的：

一种龙葵金属硫蛋白表面展示工程菌(以下简称表面展示菌株)的构建方法，其特征在于提取龙葵金属硫蛋白基因，以pYES2为出发载体，将载体上的诱导型启动子替换为组成型表达启动子，将酿酒酵母的分泌信号肽基因连在组成型启动子之后，将酿酒酵母锚定蛋白凝集素基因的3’端序列连在启动子之后，将获得的龙葵金属硫蛋白基因连在分泌信号肽基因和凝集素基因之间，将构建好的表达载体转入大肠杆菌扩增得组成型表达表面展示载体，提取载体质粒，转入酿酒酵母。

所述的构建方法，优选提取龙葵金属硫蛋白基因包括以下步骤：

(1)提取龙葵的RNA，

(2)通过反转录得到龙葵的cDNA，

(3)以cDNA为模板，通过PCR的方法扩增出龙葵的金属硫蛋白基因，

(4)琼脂糖凝胶电泳，切胶回收，连接T载体，转化大肠杆菌，

(5)挑选阳性克隆，培养，菌液PCR，测序确定，

(6)质粒提取，

(7)酶切获得带酶切位点的龙葵金属硫蛋白基因片段。

所述的构建方法，优选构建表达载体操作如下：

(1)以酿酒酵母穿梭表达载体pYES2为出发载体，将pYES2上的诱导型启动子GAL1替换为酿酒酵母组成型强启动子，丙糖磷酸异构酶启动子TPI，得到组成型表达载体pYES2-Tpi；