[发明专利]红枣中链格孢菌的多重PCR检测引物及方法

说明书

技术领域

本发明具体涉及红枣中链格孢菌的多重PCR快速检测方法与应用，属于生物技术领域。

背景技术

枣(ZizyphusjujubaMill)属鼠李科枣属植物，是一种药食同源的食品。但红枣在自然条件下贮藏容易发生真菌病害侵染引起的霉变，在霉变过程中，真菌产生的真菌毒素具有很强的毒性，会给食用者带来危害，链格孢菌是红枣霉变中的主要真菌之一，因此，对其进行快速准确的检测，对控制红枣产品的安全性具有重要意义。

传统的，链格孢菌常用分离培养和血清学方法，分别采用不同的检验程序、方法，分别报告，确诊检验结果至少需5～7d，检验方法繁琐、时间长、特异性低等，因此，快速、准确、简便的链格孢菌检测方法将是发展的方向。建立一种快速检测霉变红枣中链格孢菌的检测方法具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的是采用枣中链格孢菌特菌Alt-F1、R1扩增片段和Alt-F2，R2扩增片段设计引物，采用多重PCR对其进行鉴定，旨在为枣产品的检测链格孢菌检测提供一种快速、准确、简便新方法

本发明的技术方案如下：一种枣中链格孢菌特菌多重PCR检测方法，采取如下步骤：

(1)将霉变红枣上刮下的菌丝刮下、洗涤干燥，液氮研磨后转移至EP管中，使用试剂盒提取基因组DNA作为PCR反应的模板；

(2)从红枣真菌菌丝中提取基因组DNA，作为PCR反应的模板，分别用Alt-F1、R1扩增片段和Alt-F2，R2扩增片段设计的引物进行PCR，PCR反应体系为50μL：DNA模板2μL；10×缓冲液5μL；dNTP(每种2.5mmol/L)2μL；引物(10μM/L)各2μL；TaqDNA聚合酶(5U/μL)0.4μL；无菌水补足至50μL。PCR反应程序为：95℃预变性5min，然后94℃变性30sec，52℃退火30sec，72℃延伸40sec，35个循环，72℃延伸10min。反应结束后取5μLPCR产物加1μL6×溴酚蓝上样缓冲液，在2％琼脂糖凝胶上110V电泳35min。根据条带有无和大小判定结果。本发明的有益效果是：链格孢菌是影响红枣霉变的重要因素，霉变红枣对消费者的身体健康造成危害，而传统的链格孢菌细菌培养、血清学、生化鉴定等检测方法检测周期长(需4～7d)，操作繁琐复杂，特异性、敏感度低，不能起到有效地监测和预防作用。本发明提供的多重PCR检测方法可以弥补以上不足，提供一种链格孢菌快速高效的检测方法。多重PCR扩增结果表明：采用本发明特异引物检测的方法灵敏度高和特异性好，为红枣霉变的实时监测和快速诊断提供了有效手段，可以推广应用于果蔬加工、食品安全等领域。

附图说明

图1为Alt-F1，R1引物特异性，M：DL1000DNAMarker；1：XZJ1；2：XZJ2；3：扩展青霉；4：皮落青霉；5：根霉；6：毛霉；7：黑曲霉；8：链孢霉；9：长梗木霉；

图2为Alt-F2，R2引物特异性，M：DL1000DNAMarker；1：XZJ1；2：XZJ2；3：扩展青霉；4：皮落青霉；5：根霉；6：毛霉；7：黑曲霉；8：链孢霉；9：长梗木霉。

具体实施方式

实施例1

一种链格孢霉多重PCR快速检测方法，采用多重PCR技术一次性扩增沙门菌和大肠杆菌O78的特异基因以及细菌16srDNA的部分序列，然后通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。

本实施例所用主要试剂：

Tap酶、dNTP：均购自TaKaRa公司。真菌DNA提取试剂盒，Omega公司。

本实施例所用主要仪器：

5311型PCR仪，德国eppendorf公司；

DYCP-31DN水平电泳仪(北京六一仪器厂)；

Tanon-2500R全自动数码凝胶图像分析系统(上海天能科技有限公司)。

上述链格孢霉多重PCR快速检测方法具体包括以下步骤：

(1)合成引物

根据链格孢霉特异基因设计特异引物Alt-F1/Alt-R1，上述引物的核苷酸序列为：

Alt-F15-TGTCTTTTGCGTACTTCTTGTTTCCT-3

Alt-R15-CGACTTGTGCTGCGCTC-3

(2)将霉变红枣上刮下的菌丝刮下、洗涤干燥，液氮研磨后转移至EP管中，使用试剂盒提取基因组DNA作为PCR反应的模板；

(3)多重PCR扩增反应体系的建立