[发明专利]一种鉴定低酚棉花品种的方法

权利要求书

1.一种鉴定低酚棉花品种的方法，其特征在于，包括如下步骤：提取各供试材料的基因组DNA，在棉花26个连锁群上分别选择3条SSR引物，以各供试材料的基因组DNA为模板进行PCR扩增，分析PCR扩增结果，构建各低酚棉花品种的指纹图谱，筛选出不同品种的特征引物，其中有53对引物在不同供试材料间表现出稳定的多态性，利用最少2对特征引物组合即可将低酚棉品种区分开来；所述的53对引物编号分别为：NAU4044、NAU5499、JESPR304、NAU5384、NAU2161、BNL3441、NAU3469、NAU3386、NAU5015、NAU2121、NAU5434、NAU3206、NAU3654、BNL1604、NAU3964、BNL3255、NAU5318、BNL2590、BNL256、HAU2681、HAU2837、NAU3897、NAU3778、NAU5204NAU4863、NAU2765、NAU3736、JESPR243、NAU3733、NAU3714、BNL3955、NAU2907、NAU2162、BNL448、NAU2894、BNL852、NAU1221、BNL3806、BNL827、NAU3906、NAU2734、NAU2240、NAU5379、NAU5350、BNL3383、NAU5359、NAU3434、NAU4855和HAU2631。

2.根据权利要求1所述的鉴定低酚棉花品种的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的供试材料为我国审定的低酚陆地棉品种9份，分别是冀棉19、冀棉21、冀棉27、湘棉18号、辽棉11号、中棉所18、中棉所20、汾低99和苏研608，以及低酚海岛棉海1和有酚陆地棉品种泗抗1号作为对照品种。

3.根据权利要求1所述的鉴定低酚棉花品种的方法，其特征在于，所述的指纹图谱的构建方法为：将对照种的扩增带型记为1，后续泳道中遇到与其带型一致的记为1，不一致的记为2，遇到与带型2不一致的记为3，依次类推。获得供试品种SSR引物扩增的基因型代码后，将所有引物扩增基因型代码串联，按染色体号从小到大，先At亚组后Dt亚组的顺序依次排列，作为每一个品种的数字指纹。

4.根据权利要求1所述的鉴定低酚棉花品种的方法，其特征在于，提取基因组DNA的方法为：

(1)将5g冻叶或鲜叶放入预冷的研钵中，加入液氮研磨，分2次加入10ml新鲜配制的提取缓冲液，转入50ml的离心管中，涡旋混匀，冰浴保存10min，4℃下4000rpm离心20min，弃上清；

(2)于沉淀中加入15ml65℃预热的裂解缓冲液，并用铜丝搅松，涡旋混匀，65℃水浴30min；

(3)加入15ml体积比为24:1的氯仿和异戊醇的混合液，翻转50次以上，15℃下4000rpm离心20min，将上清转入50ml的离心管中，加0.6体积的预冷的异丙醇，缓慢翻转30次，混匀，静置10min，4000rpm，室温下离心10min，弃上清，于沉淀中加入2ml70％的乙醇洗涤，并转入10ml的离心管中，10000rpm离心5min。倒掉上清液，通风干燥20min；

(4)加3mlTE缓冲液，溶解，65℃培养10～30min，加3ml的体积比为24∶1的氯仿和异戊醇混合液，缓慢翻转50次，混匀，室温静置5min，10000rpm离心10min；

(5)上清液转入10ml离心管中，加0.1体积的pH为5.2的3M醋酸钠，加等体积的异丙醇后翻转30次，放置30min，10000rpm离心5min，弃上清液，加2ml70％乙醇洗DNA小团，10000rpm离心5min，倒掉上清液，通风干燥20min；

(6)加3mlTE缓冲液溶解，65℃培养10～30min；

(7)加5μl10mg/ml的RNAaseA，37℃温育30～60min，加等体积的体积比为24∶1的氯仿和异戊醇混合液，缓慢翻转50次，混匀，室温静置5min，10000rpm离心10min；

(8)上清液转入10ml离心管中，加0.1体积的pH为5.2的3M醋酸钠，加等体积的异丙醇后翻转30次；

(9)将絮状沉淀挑入加有800μl70％乙醇的1.5ml的离心管中，10000rpm离心5min；弃上清液，自然通风干燥DNA小团；

(10)加200μlTE缓冲液在4℃下溶解DNA1～2天，-20℃保存；

(11)以5μl北京天根100bpDNALadder作为对照，将DNA依次稀释5倍、10倍和20倍，通过1％琼脂糖凝胶电泳，确定DNA的浓度、纯度以及完整性；

(12)根据提取DNA的浓度，用TE缓冲液将DNA稀释至20ng/μl工作液，混匀备用。