[发明专利]一种胰腺癌肿瘤标志物及其应用方法

说明书

技术领域

本发明属于医学生物技术研究领域，涉及一种胰腺癌肿瘤标志物及其应用方法。所示胰腺癌肿瘤标志物为SERPINA6。SERPINA6在胰腺癌肿瘤组织中呈现高表达，并分泌至外周血中。通过检测胰腺癌病理组织中的SERPINA6表达水平或外周血清中的SERPINA6浓度，能够快速地发现和诊断胰腺癌。

背景技术

胰腺癌是一种高侵袭性、恶性程度极高的肿瘤，近年来发病率逐渐增高。胰腺癌的治疗主要为手术、化疗和放疗相结合的综合治疗，其五年生存率小于5％。因此，早期诊断对胰腺癌的治疗及预后显得尤为重要，其中，外周血检测是最常用、最易推广的诊断方法。目前临床常用的胰腺癌诊断标志物如CA19-9，在诊断肿瘤的发生和监测其复发中起到重要的作用。但是，这些标志物的特异性及敏感性往往很低，不能满足临床的需要，尤其在早期诊断价值方面，现仍缺乏一个较为灵敏的方法。

SERPINA6是丝氨酸蛋白酶抑制剂家族的成员之一，也称为皮质类固醇结合球蛋白，它是主要的糖皮质激素转运蛋白。丝氨酸蛋白酶抑制剂SERPINA6在控制不同生物过程中的蛋白酶活性方面起到关键性作用。在外周血中超过90％糖皮质激素和SERPINA6结合，当SERPINA6的羧基末端被水解后导致其构象发生改变，从而促进糖皮质激素的释放入组织。因此，SERPINA6能够直接引导糖皮质激素分配到炎症、肿瘤等组织位点，在生理及疾病发生中发挥着重要作用。

通过对四十例胰腺癌组织病理切片分析，发现SERPINA6在胰腺癌组织中呈现高表达，而周边正常胰腺组织未见阳性表达，另外还进行了一例肝癌胰腺转移的胰腺组织病理免疫组化染色，未见其肿瘤组织有阳性染色。

此外，运用时间分辨免疫荧光检测方法，对外周血清中SERPINA6进行检测，发现胰腺癌患者外周血中的SERPINA6浓度显著高于正常人、胰腺炎及胰腺囊肿患者。

发明内容

本发明的目的是提供一种胰腺癌肿瘤标志物，其为SERPINA6，也称为皮质类固醇结合球蛋白，它是丝氨酸蛋白酶抑制剂家族的成员之一。SERPINA6不仅在胰腺癌肿瘤组织中表达明显增高，而且做为分泌性蛋白，SERPINA6能够分泌到外周血中，从而在患者血清中被检测到。

本发明同时提供了两种SERPINA6检测的应用方法。一种是病理组织切片中的SERPINA6免疫组化检测，另一种是血清中SERPINA6的免疫学检测，如ELISA，时间分辨免疫荧光法，化学发光法，放免法。

本发明提供了一种检测SERPINA6的ELISA试剂盒的使用方法。另外，本发明还提供了一种检测SERPINA6的时间分辨免疫荧光试剂盒的使用方法，该试剂盒采用时间分辨免疫荧光方法，具有高特异、高灵敏的优点，是目前取代放射性免疫分析的一种定量检测方法。它的基本原理是利用三价稀土离子（如Eu³⁺）作为示踪物，延迟检测寿命较长的特异性激发荧光以排除非特异性及背景荧光的干扰，即测定复合物中的稀土离子被激发的延迟荧光强度，从而确定待测蛋白的浓度。使用荧光增强液的TRF能够检测到皮克（pg，10^－12g/ml）水平的蛋白。

一种检测SERPINA6的ELISA试剂盒的使用方法。其特征在于：所述检测SERPINA6的ELISA试剂盒包括以下组成

（1）洗涤液为含0.1%Tween-20的PBS；

（2）加样缓冲液的成分为含1%BSA的PBS，其成分为PBS，1%BSA；

（3）反应终止液为2M H₂SO₄；

（4）包被在酶标板上的单克隆小鼠抗人SERPINA6抗体，包被浓度为5μg/ml；

（5）检测抗体为生物素化的兔抗人SERPINA6多抗，储存浓度为50ng/μl；

（6）辣根过氧化物酶标记的链亲和霉素，储存浓度为0.5μg/μl；

（7）标准品，重组人SERPINA6蛋白，浓度为100μg/μl；

所述使用方法具体为以下步骤

（1）在已包被有单克隆小鼠抗人SERPINA6抗体的酶标板中加入待测培养上清样品和倍比稀释的标准品100μl/孔，37℃孵育1h；

（2）弃去样品和标准品，300μl/孔洗涤液洗涤三次；

（3）用加样缓冲液稀释检测抗体－生物素化的兔抗人SERPINA6多抗至浓度为75ng/ml，以100μl/孔加入稀释好的检测抗体，37℃孵育1h；

（4）弃去检测抗体，300μl/孔洗涤液洗涤三次；