[发明专利]一种胰腺癌肿瘤标志物及其应用方法

权利要求书

1.一种检测SERPINA6的试剂在制备用于诊断胰腺癌的时间分辨免疫荧光试剂盒中的用途，其特征在于：所述试剂盒包括以下组成：

（1）包被缓冲液，其为PBS，其成分为水，140mMNaCl，2.7mMKCl，10mMNa₂HPO₄，1.8mMKH₂PO₄，pH值为7.4；

（2）封闭液，其为含1%BSA的PBS，其成分为PBS，1%BSA；

（3）洗涤液，其为含0.05%Tween-20的Tris-HCl缓冲液，其成分为50mM的Tris-HCl缓冲液，0.05%Tween-20；

（4）加样缓冲液，其为含1%BSA的PBS，其成分为PBS，1%BSA；

（5）荧光增强液；

（6）检测缓冲液，其为50mM的Tris-HCl缓冲液，其中含有1%BSA，1%bovine globulin，0.05%Tween-40，二乙烯三胺五乙酸；

（7）包被抗体，其为单克隆小鼠抗人SERPINA6抗体，储存浓度为1μg/μl；

（8）检测抗体，其为生物素化的兔抗人SERPINA6多抗，储存浓度为50ng/μl；

（9）Eu^3＋标记的链亲和霉素，储存浓度为0.1μg/μl；

（10）标准品，重组人SERPINA6蛋白，浓度为100μg/μl；

试剂盒的使用方法具体为以下步骤：

（1）用PBS稀释包被抗体－单克隆小鼠抗人SERPINA6抗体至浓度为4ug/ml，以100μl/孔加入96孔酶标板，4℃过夜；

（2）弃去包被抗体，300μl/孔洗涤液洗涤三次，加入封闭液200μl/孔，37℃孵育1h；

（3）弃去封闭液，300μl/孔洗涤液洗涤三次，加入待测样品和倍比稀释的标准品100μl/孔，37℃孵育1h；

（4）弃去样品和标准品，300μl/孔洗涤液洗涤三次；

（5）用加样缓冲液稀释检测抗体－生物素化的兔抗人SERPINA6多抗至浓度为75ng/ml，以100μl/孔加入稀释好的检测抗体，37℃孵育1h；

（6）弃去检测抗体，300μl/孔洗涤液洗涤三次；

（7）用检测缓冲液稀释Eu^3＋标记的链亲和霉素，终浓度为500ng/ml，以100μl/孔加入酶标板，37℃避光孵育1h；

（8）弃去Eu^3＋标记的链亲和霉素，300μl/孔洗涤液洗涤四次；

（9）加入荧光增强液200μl/孔，室温避光缓慢水平摇动5min；

（10）读板：设定激发光波长为337nm，发射光波长为615nm，延时200微秒测定615nm处的荧光值；

（11）利用统计学绘图软件根据测定的值绘制标准曲线；

（12）通过标准曲线和未知浓度样品的荧光值计算待测样品中的SERPINA6的浓度；

胰腺癌患者外周血中SERPINA6的浓度显著高于正常人。