[发明专利]一种具有抗肿瘤活性的龙葵精制多糖的提取纯化方法

说明书

技术领域

本发明属药物提取纯化技术领域，特别是一种具有抗肿瘤活性的龙葵精制多糖的提取纯化方法。

背景技术

龙葵(Solanum nigrumL.)属茄科植物，其性寒味苦，微甘，有小毒，归肺、肾二经。龙葵作为传统中草药在我国各地均有分布，具有清热解毒、消肿散结、消炎利尿的功效。龙葵多糖对肉瘤S180、胃癌MFC、宫颈癌U14等均有明显的生长抑制作用，能够增加免疫器官脾脏和胸腺重量，并且能够显著延长荷瘤小鼠的生命周期，且无毒副作用或毒副作用明显低于传统的化疗药物。但对龙葵多糖的研究，大多集中于粗提取物，对其精制品的分离纯化工艺的研究未见报道。

在传统的方法中，多采用水为溶剂提取获得龙葵粗多糖；但以水为溶剂提取获得的龙葵粗多糖仍含有蛋白质、色素等杂质，这些成分的存在会影响药物的质量及安全。常用的脱蛋白方法采用Sevag法时，效率不高，操作需反复多次，成本消耗大、毒性氯仿易残留，多糖易损失；采用盐酸法时，效果虽好，但强酸性会使部分多糖降解，降低多糖活性；三氟三氯乙烷法因溶剂沸点低易挥发不宜大量使用，采用酶法脱蛋白时会受到酶的专一性所限制。

基于以上问题，寻找一种工艺简单、成本低、操作方便、得率高、纯度高的龙葵多糖纯化工艺方法，对于批量生产具有抗肿瘤活性的龙葵精制多糖用于开发抗肿瘤药物尤为重要。

发明内容

为了解决现有技术中的上述问题，本发明针对具有抗肿瘤活性的龙葵多糖为目标，提供一条简单合理、操作方便、成本低、得率高、纯度高的提取纯化工艺路线。本发明采用石油醚及乙醇进行脱脂，闪式提取，三氯乙酸脱蛋白，活性炭脱色，二次醇沉等方法制备龙葵精制多糖。

本发明的一个目的在于提供具有抗肿瘤活性的龙葵精制多糖的提取纯化方法。

一种具有抗肿瘤活性的龙葵精制多糖的提取纯化方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)龙葵粗多糖样品的制备：

龙葵饮片40-60℃干燥6-8h后，粉碎过40目筛，制得龙葵粉末；将龙葵粉末加入4-5重量倍石油醚，于50-55℃水浴条件下，加热回流脱脂2次，每次2h，过滤去液留渣；将药渣加入2倍重量的80％乙醇，于80℃水浴条件下加热回流2次，每次1h，过滤去液留渣，药渣晾干，制成已脱脂的龙葵粉末；将上述已脱脂的龙葵粉末置于闪式提取仪的容器中，加蒸馏水30重量倍，以80V电压闪式提取2次，每次2min；合并提取液，纱布过滤，以3000r/min离心15min，取上清液减压浓缩至50％药材体积，在搅拌下加入乙醇调节含醇量至80％，2-6℃静置冷藏12-24h，减压抽滤，沉淀用无水乙醇、乙醚依次洗涤2-3次后，60℃真空干燥，得龙葵粗多糖；

(2)龙葵精制多糖的纯化：

将步骤(1)所得的龙葵粗多糖用蒸馏水溶解配成质量浓度为1％的溶液，用3％-5％三氯乙酸溶液缓缓调节pH至2.5-3.0，振荡处理20min，2-6℃静置2-4h，以3000r/min离心10min去除胶状蛋白沉淀；在上清液中加入活性炭，以稀HCl调节pH至5，40℃保温脱色20min，静置1h后，以4000rpm/min离心20min除去沉淀；将上清液加入4倍量的95％乙醇沉淀，2-6℃静置冷藏12-24h，以4000rpm/min离心收集沉淀，用无水乙醇、乙醚依次洗涤2-3次后，60℃真空干燥得龙葵精制多糖。

进一步地，步骤(2)中用三氯乙酸溶液调节pH至2.5。

步骤(2)中活性炭的加入量为待处理液量的0.7％。

本发明所述龙葵饮片是指市售的经过自然或人工干燥的中药龙葵。

本发明将龙葵饮片经过预处理、脱脂、提取、脱蛋白、脱色和醇沉的步骤，得到的龙葵精制多糖。

本发明的另一个目的在于提供利用本发明的方法提取的龙葵精制多糖组分在制备抗肿瘤药物试剂中的应用。

龙葵精制多糖的抗肿瘤活性作用：采用MTT法检测利用本发明方法制得的龙葵精制多糖对肝癌细胞H22体外生长表现出明显的抑制作用，在浓度1.4-1.8mg/mL时细胞增殖抑制率为35.80-85.4％，对H22荷瘤小鼠的肿瘤体内生长也表现出明显抑制作用，给药剂量在30-60mg/kg时肿瘤生长抑制率为37.73％-42.60％，而对荷瘤小鼠的胸腺、脾脏等免疫器官并无不良影响。

有益技术效果

与现有技术相比，本发明具有以下优点及效果：