[发明专利]芽孢杆菌的分离方法及用芽孢杆菌制作发酵茶的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种芽孢杆菌的分离方法及用芽孢杆菌制作发酵茶的方法。

技术背景

目前茶叶按不同的加工方式可分为绿茶、黄茶、黑茶、白茶、青茶、红茶六类。其中除了绿茶以外，其他的五类茶都涉及到发酵过程。这五类发酵性茶饮中青、白、红、黄主要涉及的是自身酶类发酵，只有黑茶主要是通过微生物发酵而成。目前黑茶的发酵主要是由自然接种的真菌发酵而成。

中国专利200980147120.1披露了一种制备发酵茶的方法，包括制备芽孢杆菌菌株，稳定该芽孢杆菌菌株和用稳定的芽孢杆菌菌株发酵茶叶。该专利中的芽孢杆菌菌株从韩国泡菜、大酱等传统食品中分离，其主要原理与方法也是模拟韩国泡菜等的制作方法，添加外源营养成分供细菌发酵，在厌氧条件下与茶叶一起混合进行相对恒温的发酵方式。这种茶叶的发酵方法存在的缺点是：

1、由于发酵前水分含量较高、发酵过程密封，所以在发酵结束后要进行烘干处理。

2、该专利中添加的外源糖类和大豆粉，在被细菌发酵的过程中产生的香味物质是发酵茶最终的香味来源，至于菌株是否能够直接利用茶叶进行发酵产香不得而知。

3、芽孢杆菌为好氧性菌，而该发明的茶叶发酵过程为厌氧发酵，厌氧发酵过程对于好氧性的芽孢杆菌来说未必是一种很好的发酵方式。

4、在最后的烘干过程中使用100℃烘干5小时的过程对发酵茶叶的营养成分可能会产生较大破坏，且高温下风味的变化也是影响其发酵茶均一品质的重要因素。

发明内容

为了克服现有的利用芽孢杆菌制作发酵茶的方法存在发酵前水分多、发酵过程密封致使发酵完成后必须对茶叶进行烘干处理，且依赖添加的外源糖类和大豆粉被芽孢杆菌在厌氧环境发酵产生香味，非茶叶自然香味的缺点，本发明提供了一种使芽孢杆菌在好氧环境下梯度升温固体发酵茶叶，利用茶叶本身碳源与氮源进行好氧性固体发酵产生香味，茶叶水分在发酵过程中逐渐减少，发酵后不用烘干的发酵茶的制作方法及芽孢杆菌的分离方法。

芽孢杆菌的分离方法包括以下步骤：

A、初筛：茶园取土壤样，按每10g土壤样加30ML水的比例加入水，常压加热至水沸腾后维持10min以上；冷却后取得上清液，将上清液涂布于营养肉汤琼脂培养基，营养肉汤琼脂培养基的成分为：蛋白胨10g/L,牛肉膏3g/L,氯化钠5g/L,营养肉汤琼脂培养基pH值为7.2；

将涂布有上清液的营养肉汤琼脂培养基在30℃培养24小时，后挑选单个菌落进行纯化分离到纯种菌落为止；对单菌落进行芽孢生产检测，挑选能产生芽孢的细菌做下一步筛选，初筛完成；

B、纤维素酶产生菌株复筛：对初筛的菌落接种于纤维素鉴定平板，纤维素鉴定平板具有刚果红-羧甲基纤维素钠筛选培养基，筛选能产生明显透明圈的菌落进行下一步筛选；菌株能产生透明圈的菌株即能产生纤维素酶。透明圈越大表明纤维素酶活性越大。

刚果红-羧甲基纤维素钠筛选培养基的成分为：CMC-Na20g，刚果红0.2g，蛋白胨2g，K₂HPO₃0.5g，MgSO₄0.25g，土壤浸出液20mL，琼脂粉12g，蒸馏水1000mL。

C、乙偶姻产生菌株复筛选：利用V-P试验对乙偶姻生产菌株进行测定：用琼脂培养物将纤维素酶产生菌株复筛获得的菌落接种于葡萄糖蛋白胨水中；

菌落经葡萄糖蛋白胨水培养后，在35～37℃培养48-96小时，之后于每毫升培养物中加入0.1ml检测试剂，检测试剂为40g氢氧化钾溶于100ml蒸馏水中，并加入0.3g肌酐；将培养物和检测试剂猛烈摇振混合，若在5-10分钟内变成粉红色则为V-P试验阳性，即表明该菌株能生成乙偶姻。

葡萄糖蛋白胨水的成分为：葡萄糖0.5g蛋白胨0.5gK₂HPO₄0.2g水100mlpH7.2-7.4。

进一步，将通过一次初筛，两次条件性复筛得到的具有生产纤维素酶和乙偶姻的菌株按照模拟酱香型白酒的模拟高温大曲发酵方式进行产香发酵产生菌株筛选试验：

将干麦粒用组织粉碎机破碎成一半碎粒，用饮用自来水浸泡24小时，沥干水分，称取多份浸泡后的麦粒，每份浸泡后的麦粒50g、分装于250mL三角瓶中，121℃，0.1Mpa，灭菌30min。每份麦粒接种1mL筛选菌株，接种后的麦粒于摇床过夜培养菌液；培养天数为5-7天，培养温度每天梯度递增；培养完成后，挑选有香味，无氨味及刺激性气味的芽孢杆菌菌株作为茶叶发酵候选菌株。