[发明专利]芽孢杆菌的分离方法及用芽孢杆菌制作发酵茶的方法

权利要求书

1.芽孢杆菌的分离方法包括以下步骤：

A、初筛：茶园取土壤样，按每10g土壤样加30ML水的比例加入水，常压加热至水沸腾后维持10min以上；冷却后取得上清液，将上清液涂布于营养肉汤琼脂培养基，营养肉汤琼脂培养基的pH值为7.2；

将涂布有上清液的营养肉汤琼脂培养基在30℃培养24小时，后挑选单个菌落进行纯化分离到纯种菌落为止；对单菌落进行芽孢生产检测，挑选能产生芽孢的细菌做下一步筛选，初筛完成；

B、纤维素酶产生菌株复筛：对初筛的菌落接种于纤维素鉴定平板，纤维素鉴定平板具有刚果红-羧甲基纤维素钠筛选培养基，筛选能产生明显透明圈的菌落进行下一步筛选；

C、乙偶姻产生菌株复筛选：利用V-P试验对乙偶姻生产菌株进行测定：用琼脂培养物将纤维素酶产生菌株复筛获得的菌落接种于葡萄糖蛋白胨水中，葡萄糖蛋白胨水的pH值为7.2-7.4；

菌落经葡萄糖蛋白胨水培养后，在35～37℃培养48-96小时，之后检测培养物中是否存在乙偶姻，若存在乙偶姻，即表明该菌株能生成乙偶姻。

2.如权利要求1所述的芽孢杆菌的制备方法，其特征在于：步骤A中，营养肉汤琼脂培养基的成分为：蛋白胨10g/L,牛肉膏3g/L,氯化钠5g/L。

3.如权利要求2所述的芽孢杆菌的制备方法，其特征在于：步骤B中，刚果红-羧甲基纤维素钠筛选培养基的成分配比为：CMC-Na20g，刚果红0.2g，蛋白胨2g，K₂HPO₃0.5g，MgSO₄0.25g，土壤浸出液20mL，琼脂粉12g，蒸馏水1000mL。

4.如权利要求3所述的芽孢杆菌的制备方法，其特征在于：步骤C中，葡萄糖蛋白胨水的成分为：葡萄糖0.5g蛋白胨0.5gK₂HPO₄0.2g水100ml。

5.如权利要求4所述的芽孢杆菌的制备方法，其特征在于：步骤C中检测乙偶姻的方法是：于每毫升培养物中加入0.1ml检测试剂，检测试剂为40g氢氧化钾溶于100ml蒸馏水中，并加入0.3g肌酐；将培养物和检测试剂混合，若在5-10分钟内变成粉红色则为V-P试验阳性，即表明该菌株能生成乙偶姻。

6.如权利要求5所述的芽孢杆菌的制备方法，其特征在于：将通过一次初筛，两次条件性复筛得到的具有生产纤维素酶和乙偶姻的筛选菌株按照模拟酱香型白酒的模拟高温大曲发酵方式进行产香发酵产生菌株筛选试验：

将干麦粒用组织粉碎机破碎成一半碎粒，用饮用自来水浸泡24小时，沥干水分，分别称取多份浸泡后的麦粒，每份浸泡后的麦粒为50g，使每份浸泡后的麦粒在121℃，0.1Mpa下灭菌30min；每份浸泡后的麦粒接种1mL筛选菌株，接种后的麦粒于摇床过夜培养菌液，培养天数为5-7天，培养温度每天梯度递增；培养完成后，挑选有香味，无氨味及刺激性气味的芽孢杆菌菌株作为茶叶发酵候选菌株。

7.如权利要求6所述的芽孢杆菌的制备方法，其特征在于：依次为30℃、1天，35℃、1天，40℃、1天，45℃、1天，50℃、1天，共5天。