[发明专利]一种生产辅酶Q10的方法

说明书

技术领域

本发明涉及辅酶Q10生产领域，具体而言，涉及一种生产辅酶Q10的方法。

背景技术

辅酶Q10是一种抗氧化剂，广泛使用于心血管药物、保健品和化妆品。目前全球的辅酶Q10的产量大部分在中国生产，生产方法是采用类球红细菌(Rhodobactersphaeroides)作为菌种进行发酵培养后从细菌中提取产品。该菌种生长比较缓慢，采用的培养基成本较高；提高产量和降低成本的空间已经比较狭窄。

将编码某些蛋白质酶的基因转入大肠杆菌，利用大肠进行某些产品的生产，能够很好的利用大肠杆菌生长快、生长条件要求不高、培养基便宜等一系列优点。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种生产辅酶Q10的方法，通过构建的辅酶Q10基因工程菌种，生产成本大幅度降低，生产工艺简单，并且具有大幅度提高产量的空间。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种ddsA基因，其基因序列如SEQIDNo.1所示。

该基因序列是从类球红细菌高产菌种的基因组中克隆得到，设计引物为：

DPF：ATGGGATTGGACGAGGTTTC；

DPR：TCAGGCGATGCGCTCGACCA。

将扩增得到的片段进行克隆测序，结果如SEQIDNo.1所示。

一种ubiA基因，其基因序列如SEQIDNo.2所示。

该基因序列是从类球红细菌高产菌种的基因组中克隆得到，设引物为：

UPF：ATGCAGCAGCCGCGCCAAGC；

UPR：TCAGAGGAGCGCGGCTGTGG。

将扩增得到的片段进行克隆测序，结果如SEQIDNo.2所示。

所述ddsA基因和所述ubiA基因也可通过人工合成，以进行后续的工程菌的构建工作。

工程菌的构建工作可通过两种方式得到：一种是构建重组质粒表达的菌种；另一种是构建基因组重组的菌种。

本发明还提供了一种含有所述的ddsA基因或同时含有所述ddsA基因和所述ubiA基因的载体。

即可以将所述ddsA基因与载体连接，得到含有ddsA基因的表达质粒；其中，载体可选用常用的pET28A等。也可以将所述ddsA基因和所述ubiA基因连接在一个有多个多克隆位点的载体上。其中，载体可选用常用的pETDuet-1等。

这两个基因序列通过设计引物增加特定的酶切位点，PCR扩增得到的产物酶切，然后载体采用相同的酶切，两者连接即可。

具体地，所述ddsA基因与载体连接步骤如下：

设计引物：

DF：ACGGCACGGCATATGGGATTGGACGAGGTTTC

DR：ACGGCACGGCATATGTCAGGCGATGCGCTCGACCA

用以上引物对所述ddsA基因进行PCR扩增后，用NdeI酶切产物，相应地，载体pET28A也采用NdeI酶切，两者产物通过连接酶连接转化后验证插入片段朝向，即可得到含有ddsA基因的重组质粒。

另外，也可以将所述ddsA基因和所述ubiA基因连接在一个载体上，通过设计引物，使不同基因携带不同的酶切位点，然后与载体的多克隆位点对应，通过酶切，连接，转化和验证插入片段朝向即可得到。

具体地，所述ddsA基因与载体连接步骤如下：

设计引物：

DF：ACGGCACGGCATATGGGATTGGACGAGGTTTC

DR：ACGGCACGGCATATGTCAGGCGATGCGCTCGACCA

用以上引物对所述ddsA基因进行PCR扩增后，用NdeI酶切产物，相应地，载体pETDuet-1也采用NdeI酶切，两者产物通过连接酶连接转化后验证插入片段朝向，即可得到含有ddsA基因的重组质粒。

所述ubiA基因与载体连接步骤如下：

设计引物：

UF：CGCGGATCCATGCAGCAGCCGCGCCAAGC

UR：CGCGGATCCTCAGAGGAGCGCGGCTGTGG

用以上引物对所述ubiA基因PCR扩增后，用BamHI酶切产物，相应地，含有ddsA基因的重组质粒也采用BamHI酶切，两者产物通过连接酶连接转化后验证插入片段朝向，即可得到含有所述ddsA基因和所述ubiA基因的重组质粒。