[发明专利]牛布鲁氏菌间接ELISA抗体检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种动物布鲁氏菌病的诊断方法——牛布鲁氏菌间接ELISA抗体检测试剂盒，属生物制品检测技术领域。

技术背景

布鲁氏菌病(布病)是由布鲁氏菌或称布鲁氏菌(Brucella)引起的以流产和发热为特征的人兽共患病，严重地威胁着人和多种动物的生命健康。本病不但对动物的繁殖和生产性能具有严重危害，更重要的是，人感染布鲁氏菌后，往往难以治愈，从而造成严重的公共卫生问题。因此在布鲁氏菌流行的国家，消除布病一直是公共卫生计划中最重要的目标之一。

布病在世界存在已有久远的历史，人类对该病的研究认识逐步加深，诊断水平不断提高，随着动物布病的研究进展，动物布病血清学的检测方法不断改进和提高。传统的凝集试验(如：虎红抗原平板凝集试验、试管抗原凝集试验、乳环凝集试验)逐渐被敏感性高、特异性强的ELISA方法、荧光偏振试验(FPA)等新的检测技术所取代。

凝集试验是布鲁氏菌病诊断的一种常用的方法，包括血清凝集实验、乳环沉淀试验和抗人免疫球蛋白试验，其中经典的标准试管凝集试验(STAT)、平板凝集试验(PAT)，以上方法在发达国家已经基本停止使用，取而代之的是缓冲布鲁氏菌抗原凝集试验如虎红平板凝集试验(RBPT)。虎红平板凝集抗原是用抗原性良好的布鲁氏菌菌株经培养，灭活，离心收集菌体后用虎红染料染色后悬浮于乳酸缓冲液中制成，该方法灵敏度高，价格便宜，操作方便，检测快速，适于动物群体布鲁氏菌病的普查。在国际贸易中是牛、羊、猪布鲁氏菌病检测的指定试验，在我国也用于人布鲁氏菌病监测的初筛。乳环沉淀试验依然是乳牛布鲁氏菌监测的主要方法，该方法直接对牛乳进行检测，可以对奶牛群体进行筛检，该方法简便快速。凝集试验主要检测抗布鲁氏菌LPS－O链的抗体，而布鲁氏菌的LPS－O链是多种革兰氏阴性菌的共同抗原，因此布鲁氏菌与其他革兰氏阴性菌存在的交叉感染用试管凝集试验无法鉴别，这也是布鲁氏菌病诊断存在的一大难题。

在布鲁氏菌病血清学检验中一致认为补体结合试验(CFT)在特异性上优于其他方法，常被用来对试管凝集试验和虎红平板凝集试验检测为阳性或可疑的病例进行定性检测。补体结合试验一直被认为是最有效的布病诊断方法，至今尚没有一种诊断方法能取代补体结合试验在血清学诊断中的地位。但补体结合试验所需要的溶血素的制备困难，试验操作繁琐，难以在临床上普遍使用，而且由于猪体内的补体会干扰豚鼠补体的作用，导致敏感性下降。

ELISA是一种与CFT效果相当的诊断方法，该方法操作方便，灵敏度高，特异性较好，一次可以完成大量样品的检测，既可以作为筛选试验应用于动物群体检疫，还可以作为确诊试验。ELISA不仅可以应用于血清抗体的检测，还可应用于乳样中抗体的检测。牛布鲁氏菌病ELISA检测方法已是国际贸易中指定的检测方法之一，该方法解决了常规方法耗时费力的不足，提高了检测的特异性、敏感性和便捷性。用于布鲁氏菌病检测的ELISA有间接ELISA(iELISA)和竞争ELISA(cELISA)两种。目前研究报道的或已经商业化生产的布鲁氏菌iELISA和cELISA试剂盒存在的主要技术缺陷在于不能有效排除耶尔森氏菌O9和大肠杆菌O157感染动物的血清干扰，从而使其特异性受到一定程度影响。申请人曾经筛选获得了一株只与布鲁氏菌反应，不与耶尔森氏菌O9和大肠杆菌O157反应的特异性单克隆抗体，并在此基础上开发了动物布鲁氏菌cELISA试剂盒，该技术不仅已经获得了专利证书(专利号：ZL201310213811.5)，而且已经完成了中试、临床试验，并通过了新兽药评审初审，正在进行制品的质量复核检验。本发明主要是通过筛选特定布鲁氏菌，提取其脂多糖(LPS作为包被抗原，并对包被抗原提纯工艺以及试剂盒组分进行优化，成功开发了高特异性和敏感性的牛布鲁氏菌间接ELISA抗体检测试剂盒，丰富了我国布病诊断技术。