[发明专利]皮质醇免疫原、衍生物、抗体、检测试剂及制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及皮质醇免疫原、衍生物、抗体、检测试剂及制备方法。

背景技术

皮质醇(Hydrocortisone)，其结构式如式(Ⅲ)所示：

皮质醇又称氢化可的松，是肾上腺在应激反应中产生的一种甾体类激素。皮质醇是主要的糖皮质激素，参与人体内性激素代谢，并能影响机体糖、脂肪、蛋白质的代谢以及调节机体中水、电解质平衡等一系列生命活动。人体每日分泌皮质醇总量约为200mg，且分泌量根据每日时辰(24h)呈现明显的周期性变化。皮质醇分泌进入血液后，绝大部分与类固醇激素结合球蛋白(CBG)结合。血液中游离的皮质醇只占皮质醇总量的1％-3％，但只有游离的皮质醇才具有生物活性。通常游离皮质醇与结合皮质醇保持相对平衡，但在机体创伤、感染、运动、情绪激动等情况下其含量均有显著升高，肾上腺分泌皮质醇机能亢进或者低下也会产生特征性的临床表现。因此，在当前临床医学和药物学研究及实践中，测定皮质醇的水平已成为一项重要的指标。

目前，皮质醇的检测方法主要包括：高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱串联质谱联用法(LC/MS/MS)，放射免疫分析法(RIA)、化学发光免疫分析法(CLIA)和酶联免疫分析法(ELISA)等。这些检测方法各有其优劣之处，但是在临床大规模应用上都有一定的局限性。目前市场上缺乏稳定性好、灵敏度高、特异性强的皮质醇检测试剂，尤其是质量好的自动化检验试剂，因此，研发一种质量达到临床要求、实用性强、性价比高，可应用于全自动生化分析仪的皮质醇测定试剂已成为国内外体外诊断试剂行业的热点。

发明内容

本发明为了克服现有技术存在的缺陷，采用独特的皮质醇衍生物制备免疫原性强的皮质醇免疫原及其抗体，用该抗体制备的皮质醇均相酶免疫检测试剂可以实现在全自动生化分析仪上对皮质醇高通量、快速化的检测。该检测试剂具有操作简便、灵敏度高、特异性强、结果准确等优点，还能有效降低皮质醇检测成本，有利于临床推广使用。

本发明的一个目的在于提供一种免疫原性强的皮质醇免疫原。

本发明的又一个目的在于提供一种用于形成皮质醇免疫原的皮质醇衍生物。

本发明的另一个目的在于提供一种皮质醇免疫原的制备方法。

本发明的又一个目的在于提供使用本发明皮质醇免疫原制备得到的特异性强的抗皮质醇特异性抗体。

本发明的再一个目的在于提供一种皮质醇检测试剂及其制备方法。

本发明的皮质醇免疫原，免疫原性高，可以诱导得到高效价的抗皮质醇特异性抗体。该抗体特异性高，与皮质醇的结合力强。由该抗体制备得到的皮质醇检测试剂，可以快速、准确地确定样品中的皮质醇含量。本发明是通过以下技术方案实现的：

一种皮质醇免疫原，其结构式如式(Ⅰ)所示：

载体为具有免疫原性的蛋白质或多肽，选自血清蛋白、血蓝蛋白和甲状腺球蛋白的一种。更优选为血清白蛋白，进一步优选为牛血清白蛋白。

所述的皮质醇免疫原由皮质醇衍生物与上述载体连接而成。一种皮质醇衍生物，其化学结构如式(Ⅱ)所示：

皮质醇免疫原的制备方法，包括以下步骤：

(1)将载体蛋白100～300mg溶解于25～75ml0.2M，pH8.5的磷酸缓冲液中；

(2)将如下化学品加入到小烧杯中搅拌溶解：100～300mg皮质醇衍生物、1.75～5.25ml二甲基甲酰胺、1.75～5.25ml乙醇、3.5～10.5ml10mM，pH5.0的磷酸钾缓冲液、100～300mg1-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亚胺、25～75mgN-羟基硫代琥珀酰亚胺，将这些化学品在室温下搅拌溶解反应30～60min；

(3)将溶解好的溶液滴加至载体蛋白溶液中，并在2～8℃下搅拌过夜，得到抗原；将合成好的抗原经过透析进行纯化，得到皮质醇免疫原。

一种抗皮质醇特异性抗体，为由皮质醇免疫原免疫实验动物后产生的完整抗体分子，或者为保留与皮质醇特异性结合能力的抗体片段或抗体衍生物。

所述的完整的抗体分子、抗体片段或抗体衍生物，为采用单一的皮质醇免疫原对动物加强免疫所获得的多克隆抗体，或者为免疫后经体细胞杂交获得的单克隆抗体；所述的实验动物为兔、山羊、小鼠、绵羊、豚鼠或马的一种。优选为兔。

所述的抗皮质醇特异性抗体由上述制得的皮质醇免疫原采用常规方法接种实验动物，加强免疫后取抗血清。抗皮质醇特异性抗体的制备方法，包括以下步骤：