[发明专利]一种镍‑白蛋白螯合物及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及检测领域，更具体地说，涉及一种镍-白蛋白螯合物及其制备方法和应用。

背景技术

血清白蛋白(HSA)是哺乳动物血浆中含量最丰富的蛋白质，它能够储存和转运众多的内源性和外源性物质，这与它特异性结构密切相关。血清白蛋白是由肝脏合成的一种简单蛋白质，仅由氨基酸组成，没有修饰基团和其他附属物。根据数据资料显示，牛血清白蛋白(BSA)分子由583个氨基酸残基组成。而人血清白蛋白(HSA)比BSA多2个氨基酸，即585个氨基酸残基组成。两者的差异在于BSA缺失HSA氨基酸序列116位和585位的残基。白蛋白氨基酸成分最显著的特征是低含量的色氨酸，HSA和BSA每分子中分别含有1或2个残基。苯丙氨酸和异亮氨酸含量也比较低。半胱氨酸、亮氨酸、谷氨酸和赖氨酸含量都非常高。大量的离子化残基提供了白蛋白非常高的电荷，在PH7的条件下，每分子白蛋白带有185个离子，这样就形成白蛋白易溶性。

白蛋白最独特的结构特点是二硫键模式。BSA序列包含35个半胱氨酸残基，形成17个二硫桥,相邻的半胱氨酸对与链上最近的残基连结，形成10-47个残基长度的一对环。S-S键交迭增加了白蛋白结构的刚性和稳定性。

白蛋白的三级结构被认为是一种高度螺旋的分子，通过X射线衍射得知HNI晶体中大约67％的残基参与形成了28个α一螺旋体，10％残基参与形成β转角，23％残基形成伸展链。

生理机制上，白蛋白维持人体血浆胶体渗透压的80％。另外，白蛋白也是血液中各种大分子物质的主要载体，在代谢物转运、生物转化中发挥着重要作用。它同时也是调节凝血功能和炎性反应的组分。人血清白蛋白主要应用于临床、新陈代谢和遗传方面的研究。

镍作为一种常见的有毒金属，广泛应用于生活、生产之中，包括生产硬币、珠宝、镍合金不锈钢、制造Ni-Cd电池等，与人们的生活息息相关。随着科技的进步，人们将镍作为催化剂用于生产碳纳米颗粒的生产之中，又进一步加深了镍对于人类的影响。对于普通人群，镍主要是通过食入、饮入、接触等方式摄入镍，当然吸烟也是一重要途径。研究发现，过量的镍会导致机体多处组织及器官损伤，导致多种疾病的发生，包括呼吸系统疾病(肺炎、支气管炎、肺纤维化、哮喘、肺水肿等)、心血管疾病、肾脏疾病、皮肤疾病等，甚至还会导致肿瘤的发生。

流行病学资料显示，长期接触镍的工人，其患呼吸系统肿瘤的几率大大增加，并且其因呼吸系统肿瘤致死的几率也大大增加。动物模型、体外模型试验也发现，镍可以诱导肿瘤的发生。1990年，国际癌症研究机构(International Agency for Research on Cancer，IARC)已将镍化合物作为第一类致癌物质(Group 1)，将金属镍作为2B类致癌物质(Group 2B)。可见，镍严重威胁人体的健康。

镍与多种蛋白质之间关系密切，可以与多种蛋白质结合，抑制多种蛋白酶的活性。随着对镍毒性研究的深入，人们逐渐认识到镍与蛋白的相互作用在其致毒过程中扮演着重要的角色，被认为是了解镍的毒性机理的关键所在，因此，对镍和蛋白质相互作用的研究就显得愈发重要。而现在关于镍与蛋白质作用的机理仅是冰山一角，还有很多蛋白质与镍之间的关系还不清楚，因而加强对于镍与蛋白质之间的关系至关重要。

发明内容

针对镍污染严重的问题，本发明的目的在于提供一种镍-白蛋白螯合物及其制备方法，并建立镍-白蛋白螯合物的定性、定量检测方法，以便定量检测镍-白蛋白螯合物在评价一个地区镍污染程度的应用。通过定量检测一个地区人群血清中镍-白蛋白螯合物可以间接反映这个地区人群受镍污染的情况，从而间接反映这个地区镍污染程度。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：提供一种镍-白蛋白螯合物，镍离子与白蛋白通过巯基或/和半胱氨酸残基螯合而成。

本发明还提供一种上述的镍-白蛋白螯合物的制备方法，包括以下步骤：

A)镍与白蛋白的螯合反应：在提纯源于人体的白蛋白或按照生物学方法重组的白蛋白中加入镍离子进行螯合反应，得到反应溶液；

B)纯化镍-白蛋白螯合物的提取：采用免疫亲和层析法，去除反应溶液中未反应的白蛋白以及多余的镍离子，即得镍-白蛋白螯合物。

其中，体外合成法中所述步骤B)具体如下：

(1)溶解样品：向经过步骤A)得到的反应溶液中加入生理盐水使镍-白蛋白螯合物复溶；

(2)平衡层析柱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱的管路，在层析柱中装入能与白蛋白特异性结合的填料，装柱后，继续使用稀释缓冲液平衡层析柱；