[发明专利]一种唐菖蒲伯克霍尔德菌株及其发酵生产碱性脂肪酶的方法

说明书

技术领域

本发明涉及微生物及酶，特别涉及一种伯克霍尔德菌株及其发酵生产碱性脂肪酶的方法。

背景技术

脂肪酶(EC 3.1.1.3)是一类特殊的酯键水解酶，是具有多重催化功能的生物催化剂，能催化底物的水解、酸解、醇解、氨解、转酯以及酯化合成反应，被广泛应用于食品工业、造纸业、洗涤工业、医药领域以及相关的行业和领域中。

脂肪酶催化反应的机理与丝氨酸蛋白酶类似，由活性中心丝氨酸残基上的羟基对底物羰基C原子发起亲核进攻，形成四面体中间复合物，醇基从复合物上脱落后形成酰基-酶复合体，它是脂肪酶不同催化反应的关键中间体。在水相中，脂肪酶可催化各种油脂的水解。而在有机相中，酶催化的有机反应具有条件温和、无环境污染、速率快、选择性高等优点，脂肪酶可催化酯合成、转酯等反应。尽管非水相酶催化反应具有以上优点和催化后处理方便等优点，但脂肪酶的活性和稳定性受传统的有机溶剂限制。寻找一种能在有机溶剂中酶活性高和稳定性好的脂肪酶就很有必要。

脂肪酶在微生物界分布很广，目前已发现假单孢菌、曲霉、青霉、微球菌等多种微生物可产脂肪酶。据不完全统计，细菌有28个属、放线菌4个属、酵母菌10个属、其它真菌23个属均能产脂肪酶。在各种来源的脂肪酶中，以细菌脂肪酶在有机相中催化的反应类型多、反应活性及稳定性最高，而伯克霍尔德菌属(Burkholderia sp.)菌株产生的脂肪酶具有良好的温度稳定性、有机溶剂耐受性、严格的对映体选择性等诸多优点，已引起学界及业界的高度关注，包括Amano公司在内的商业化生产公司已将其作为一种特殊行业脂肪酶制剂予以开发，该酶在生物质能源、有机合成、药物手性拆分和工具酶等领域的应用前景十分广阔。因此，提供一种高产脂肪酶的伯克霍尔德菌菌株及利用该菌发酵生产碱性脂肪酶的方法具有重要意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种能高产碱性脂肪酶的菌株及其制备碱性脂肪酶的方法。

本发明技术方案如下：

一种高产碱性脂肪酶的微生物菌株，来源于腐败洋葱，该菌株的分类属伯克氏菌科(Burkholderiaceae)伯克霍尔德菌属(Burkholderia)的唐菖蒲伯克霍尔德菌(Burkholderia gladioli)，将其命名为Burkholderia gladioli BPS-1，已于2015年2月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.10533。

所述菌株BPS-1的形态学特征如下：革兰氏阴性菌，菌落呈淡黄色，圆形，边缘整齐，光滑湿润，生长两天后产生黄色色素，专性好氧，细胞呈棒状，富有运动性，无芽孢，也不产孢子，生长温度为30-35℃，生长pH值为5.0-8.0，最适为pH值为6.5-7.5。

所述菌株BPS-1采用16SrDNA的分子生物学和Biolog自动微生物鉴定系统进行鉴定，结果如下：

1.经过对BPS-1的16SrDNA的序列比对，与Burkholderia gladioli的序列同源性最高达到100％，具体DNA序列详见序列表。

2.Biolog鉴定为Burkholderia gladioli，SIM值(培养24h)为0.575。

一种利用菌株BPS-1制备碱性脂肪酶的方法，包含以下制备步骤：

(1)种子培养：将保藏的BPS-1菌株经活化后，接种于液体LB培养基中，30-35℃培养12-18小时，得到种子培养液；

(2)发酵培养：将种子液按1-1.5％(V/V)的量接种到发酵培养基，连续培养48-72小时后，8000r/mim离心10min，收集富含脂肪酶的发酵上清液；所述发酵培养基成分为：糖蜜0.5-1.0％(V/V)、棕榈油0.25-0.5％(V/V)；氮源蛋白胨1-1.5％(W/V)、KH₂PO₄0.2-0.25％(W/V)、MgSO₄·7H₂O 0.05-0.1％(W/V)。采用所述发酵培养基三角摇瓶发酵72小时后，发酵液脂肪酶活力可达145.67U/mL。

酶活单位(U)定义：每分钟分解pNPP产生1μmol对硝基苯酚所需的酶量定义为一个酶活单位。

(3)分离纯化：将上述发酵液经乙醇沉淀、阴离子交换层析及凝胶过滤层析三步纯化获得电泳纯的碱性脂肪酶。纯化后的脂肪酶比活力达到443904.8U/mg。