[发明专利]一种全人源抗破伤风毒素单克隆抗体及其衍生物制备方法和应用

说明书

本发明提供了一种人源抗破伤风毒素单克隆抗体，所述单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:3，轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:4。优选地，所述单克隆抗体的重链的氨基酸序列为SEQ ID NO:1，所述单克隆抗体的轻链的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。另一方面，本发明还提供了上述抗破伤风毒素单克隆抗体及其衍生物的制备方法及用途。本发明提供的人源抗破伤风毒素抗体可消除过敏反应和病毒污染的生物风险，有充分长的半衰期，具有较高的效价和体内活性，并且可以大规模工业化生产。

技术领域

本发明属于生物免疫技术领域，具体涉及中和破伤风毒素的基因重组全人源单克隆抗体。

背景技术

破伤风(Tetanus)是由破伤风梭状芽孢杆菌(Clostridium tetani)感染所引起的，是一种常见的且死亡率很高的人畜共患的严重疾病。破伤风梭状芽孢杆菌广泛地存在于土壤，灰尘和铁锈等处，在多种动物的消化道和粪便中也都有发现，人群中的携带率最高可达25％。破伤风梭状芽孢杆菌很容易通过创伤感染人体，例如一般性外伤、妇女生产时的创伤等。当人被破伤风梭状芽孢杆菌感染之后，在七天左右的潜伏期内，破伤风梭状芽孢杆菌在厌氧条件下于创口处大量生长繁殖并释放毒素。破伤风毒素通过破坏人体神经细胞而侵害中枢神经系统，导致患者全身性肌肉强直性痉挛，形成破伤风特有的牙关禁闭、角弓反张等症状，严重者最后会死于窒息及全身性衰竭，死亡率在40％-78％之间。产妇分娩感染时，其病死率可高达90％以上。

破伤风梭状芽孢杆菌为严格厌氧菌，其芽孢可抗高温抗干燥，对大多数防腐剂有抗性，但对碘的水溶液及中性戊二醛溶液很敏感，可在短时间内被这些试剂杀灭。破伤风梭状芽孢杆菌可以产生两种外毒素：一种是具有溶血作用的破伤风溶血毒素；另一种是破伤风痉挛毒素，即常说的破伤风毒素。

破伤风毒素是由破伤风梭状芽孢杆菌产生并分泌至菌体外的一种蛋白质，由1315个氨基酸组成，相对分子质量为150kDa。破伤风毒素在菌体内表达后是单一的一条蛋白质链，在分泌过程中被蛋白酶裂解成由二硫键链接的轻链和重链。依据功能的不同，破伤风毒素分子分为A、B、C三个部分：破伤风毒素的轻链片段为A片段，重链N端的一半为B片段，另一半为C片段。破伤风毒素的毒性过程一般分为结合、导入和作用三步。研究结果表明，破伤风毒素的C片段可以和破伤风毒素的受体结合。破伤风毒素的受体一般认为是神经节苷脂，破伤风毒素的C片段具有逆行轴突运输进入中枢神经系统的功能，已被用于研究亚单位疫苗；B片段可以在人工磷脂膜上形成离子通道，将破伤风毒素的活性片段导入到细胞内；破伤风毒素的A片段分子是Zn蛋白酶，具有蛋白酶活性，它可以裂解神经细胞膜上的传送神经递质的蛋白质-囊泡相关膜蛋白，从而抑制神经递质的释放，使兴奋的冲动不停传递，导致患者产生强直性痉挛的临床症状。

破伤风毒素是已知最毒的毒素之一，经纯化的破伤风毒素对小鼠的致死剂量为0.l ng/kg，对豚鼠的致死剂量为0.3ng/kg，推测对人的致死剂量为0.25ng/kg。破伤风类毒素疫苗作为主动免疫疗法被应用于破伤风的预防。破伤风类毒素是用破伤风梭状芽孢杆菌菌种在适宜的培养基中培养产生的毒素，经甲醛脱毒、精制并加入氢氧化铝佐剂后可以制成疫苗。虽然注射破伤风疫苗可以完全预防破伤风的临床症状，但由于没有接种疫苗或免疫效应过期从而导致破伤风杆菌感染的情况依然非常普遍。

破伤风毒素毒性极强，作用迅速。当病人被确诊为感染破伤风杆菌后，由于此时体内已有大量细菌和毒素，使用抗菌素已来不及拯救病人生命。因此预防和治疗方法破伤风的唯一有效的方法是及时注射抗破伤风毒素的抗体，与毒素进行中和反应而使毒素失活，并通过抗体受体的介导将毒素从体内清除。