[发明专利]一种生物法合成(R)-(-)-扁桃酸的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及一种生物法合成(R)‐(‐)‐扁桃酸的方法。

背景技术

扁桃酸是极其重要的手性药物中间体，具有消炎和杀菌的双重作用。目前，在国际市场上，对扁桃酸的需求约以年均10％左右的速度增长，尤其是(R)‐(‐)‐扁桃酸早已成为国内外急需的产品。

(R)‐(‐)‐扁桃酸及其衍生物是合成环扁桃酯、羟苄唑、匹莫林等血管扩张剂、杀菌剂、镇痉剂的重要药物中间体，且具有很好的生物分解性，是目前最受瞩目的酸性光学拆分剂，可使多数外消旋体胺类和氨基酸类经非对映体异构盐形成法进行光学拆分，如止咳药甲吗南的中间体八氢异喳琳衍生物可由(R)‐(‐)‐扁桃酸拆分。

目前，常见的制备扁桃酸旋光性单体的方法大致有：(1)物理化学法，其中包括不对称合成法、光学异构体拆分法和层析法等，不对称合成法可直接化学合成扁桃酸的异构体，拆分法先合成外消旋体扁桃酸，再拆分获得手性扁桃酸；(2)生物合成法，国外文献报道制备手性扁桃酸大致有3种方法：

1、以苯甲醛和氢氰酸为原料，先制得扁桃腈，后在腈水解酶的作用下，得到(R)‐(‐)‐扁桃酸，但是该方法仅是(R)‐(‐)‐扁桃酸生产的一种研究方向，由于受限于已知的腈水解酶活力较低，目前还达不到工业化生产的要求。

2、先合成扁桃酸外消旋体，而后酯化或氨解获得扁桃酸酯或扁桃酸酰胺，再在酯化水解酶或酰胺水解酶的作用下，得到单一对映体扁桃酸，但是该方法同样仅是(R)‐(‐)‐扁桃酸生产的一种研究方向，目前受限于已知的酯化水解酶及酰胺水解酶活力较低，立体选择型较差，得到的(R)‐(‐)‐扁桃酸纯度低，目前也达不到工业应用的要求。

3、以苯乙酮酸为底物直接利用具有氧化还原酶的微生物催化合成手性扁桃酸，但是该方法也仅是一种研究方向，同样受限于目前已报道的酶活力低等问题，工业化应用困难。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种生物法合成(R)‐(‐)‐扁桃酸的方法，该方法的反应条件温和，并且原料扁桃腈具有较高的转化率。

为达到上述目的，本发明的解决方案是：

一种生物法合成(R)‐(‐)‐扁桃酸的方法，其包括如下步骤：将扁桃腈流加入转化液中，在pH为6.0‐9.0和温度为20‐40℃的条件下反应20‐24h，停止流加并继续反应2‐6h，得到(R)‐(‐)‐ 扁桃酸；其中，上述的转化液含有用于分泌J2315腈水解酶的E.coli工程菌。

其中，整个流加反应过程(20‐24h)可以分为若干个不同的阶段，每个阶段采用不同的流加速度，但要确保前一个阶段的流加速度大于后一个阶段的流加速度。在本发明的优选实施例中，整个流加反应过程(20‐24h)可以分为两个阶段，在第一个阶段(10‐12h)将扁桃腈以第一流加速度进行流加，在第二个阶段(即剩余的流加反应时间)以第二流加速度进行流加，但要保证第一流加速度大于第二流加速度。

进一步地，第一流加速度可以为10‐40gL^‐1h^‐1，第二流加速度可以为5‐20gL^‐1h^‐1；另外，第一流加速度还可以优选为15‐35gL^‐1h^‐1，第二流加速度还可以优选为7.5‐17.5gL^‐1h^‐1；进一步地，第一流加速度还可以优选为20‐30gL^‐1h^‐1，第二流加速度还可以优选为10‐15gL^‐1h^‐1；更进一步地，第一流加速度还可以优选为24gL^‐1h^‐1，第二流加速度还可以优选为12gL^‐1h^‐1。

在本发明的优选实施例中，pH可以优选为7‐8.5，还可以进一步优选为7.9‐8.1。

在本发明的优选实施例中，温度可以优选为25‐37℃，还可以进一步优选为30℃。

在上述步骤中，转化液的制备方法包括如下步骤：

(1)、将E.coli工程菌在发酵培养基中进行扩增培养，离心以得到静息细胞；

(2)、收集静息细胞，并将其悬浮在pH为6.0‐9.0的缓冲液中，得到转化液。