[发明专利]鸭甲肝病毒1型、3型和番鸭细小病毒多重PCR检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于PCR检测技术领域，尤其涉及一种鸭甲肝病毒1、3型和番鸭细小病毒多重PCR检测试剂盒。

背景技术

鸭甲肝病毒可引起3周龄以内雏鸭肝脏肿大及出血，对雏鸭的致死率高达到90％以上，是危害养鸭业发展的最为严重的病原之一。鸭甲肝病毒根据其血清型可分为鸭甲肝病毒1型(DHAV-1)、鸭甲肝病毒2型(DHAV-2)和鸭甲肝病毒3型(DHAV-3)，分别对应传统的血清Ⅰ型，台湾新型和韩国新型鸭肝炎病毒。目前，我国流行的鸭甲肝病毒主要为DHAV-1和DHAV-3。番鸭细小病毒(MDPV)主要侵害3周龄以内雏鸭，感染雏鸭后可以起雏鸭喘气、腹泻和胰脏坏死和出血，对雏鸭的致死率可达到40％以上也是制约我国番鸭饲养业发展的最为严重的传染病之一。由于DHAV-1、DHAV-3和MDPV是雏鸭最易感并且致死率非常高的病毒，而DHAV-1和DHAV-3所导致的鸭病毒性肝炎临床症状和病理变化又非常相似，以致常常不能及时诊断和有效防控而给养殖业带来巨大经济损失。

目前，对这些病毒传统的检测方法主要有病毒分离、血清学试验、琼脂扩散试验和酶联免疫吸附试验等，但这些方法存在耗时长、敏感性差、难标准化等局限性，尤其是当这两种病毒混合感染时，更是增加了临床诊断的难度。

PCR技术实现了对模板的定量检测，而且具有敏感、特异、准确可靠、能实现多重反应等特点。在实际应用中，当样品量非常大时，单重PCR在成本和时间方面就存在一定的劣势，迫切需要一种高通量、低成本、高效率的方法来进行批量的快速检测。多重PCR采用多对引物扩增检测多个模板，克服了单重PCR的不足。然而，建立多重PCR方法比单重要复杂得多，其对试剂和引物的要求更高，同时需要保证不同引物间无相互干扰。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种敏感性高、特异性强、操作简便快速的鸭甲肝病毒1型、3型和番鸭细小病毒多重PCR检测试剂盒。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：鸭甲肝病毒1型、3型和番鸭细小病毒多重PCR检测引物组，包括三对特异性引物，分别是引物1和2(检测DHAV-1)、引物3和4(检测DHAV-3)、引物5和6(检测MDPV)，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.6的碱基序列。

引物1、引物2、引物3、引物4、引物5、引物6的摩尔比为0.5-1∶0.5-1∶1∶1∶1∶1。

引物1、引物2、引物3、引物4、引物5、引物6的摩尔比为1∶1∶1∶1∶1∶1。

上述鸭甲肝病毒1型、3型和番鸭细小病毒多重PCR检测引物组在PCR扩增方面的非诊断应用，PCR扩增的退火温度为50.0℃-60.1℃。

PCR扩增的退火温度为50.0℃。

鸭甲肝病毒1型、3型和番鸭细小病毒多重PCR检测试剂盒，包括引物组、PCR缓冲液和水；

引物组包括三对特异性引物，分别是引物1和2、引物3和4、引物5和6，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.6的碱基序列，其浓度均为25μmol/mL，在PCR反应体系中的终浓度分别为0.1μmol/mL-0.5μmol/mL、0.1μmol/mL-0.5μmol/mL、0.5μmol/mL-1.0μmol/mL；

PCR缓冲液为2×Taq PCR Mix。

引物1和2、引物3和4、引物5和6在PCR反应体系中的终浓度分别为0.5μmol/mL、0.3μmol/mL、0.7μmol/mL。

上述鸭甲肝病毒1型、3型和番鸭细小病毒多重PCR检测试剂盒在PCR扩增方面的非诊断应用，PCR扩增的退火温度为50.0℃-60.1℃。

PCR扩增的退火温度为50.0℃。

针对目前缺乏对鸭甲肝病毒1型、3型和番鸭细小病毒进行检测和诊断的有效可靠的技术，发明人结合多重PCR一管多检、高通量、低成本、高效率等优点，研究设计了三对特异性引物，据此建立了鉴别和同时检测鸭甲肝病毒1型、3型和番鸭细小病毒的多重PCR检测方法，并制备了相应的检测试剂盒。实验证明，应用本发明可检测DHAV-1、DHAV-3和MDPV，并能同时鉴别检测DHAV-1、DHAV-3，具有操作简便、敏感性高、特异性强等优点，既可以节约时间的成本，又可以减少污染。

附图说明