[发明专利]一种人源杀虫蛋白及其制备方法与应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，特别是一种人源杀虫蛋白及其制备方法与应用。

背景技术

苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis, Bt）是一种昆虫病原菌，其主要杀虫活性物质为细胞内毒素伴胞晶体蛋白，对多种农业害虫具有特异性毒杀作用（Bravo and Soberon，2008）；Cry1B是Bt毒素的一种，其对鳞翅目昆虫的靶标受体主要包括中肠刷状缘膜囊泡（brush border membrane vesicles，BBMV）上的胺肽酶（aminopeptidase N，APN）和钙粘蛋白（cadherin）((Bravo et al., 2004; Pigott and Ellar, 2007)，APN属于锌结合金属蛋白酶家族蛋白，它的碳端结合部位富含N-乙酰氨半乳糖胺（N-acetylgalactosamine，GalNAc），这些区域就是同Cry1B类毒素的结合位点（ Knight et al., 1994；Knight et al., 2004）。抗Cry1B毒素独特型单链抗体（ Anti-idiotype antibody scFvs,Anti-Id scFvs) ，可以模拟Cry1B毒素的结构与功能，因此推测其受体也是昆虫BBMV上的APN。

Bt毒素使用量增加使其在害虫抗药性及次生害虫上升等方面存在生态风险 (Bravo and Soberon, 2008；Pigott et al, 2008)，这一现状促使高特异活性和新功能类的Bt毒素抗虫资源的积极开发，Cry1B毒素抗独特型单链抗体由于可模拟Cry1B毒素并与其竞争受体蛋白，已成为目前国内外科研的重点，公开号为CN103773775A的中国专利公开了一种人源抗虫基因及其编码的抗Cry1B毒素独特型单链抗体C7（以下简称C7），其能模拟Bt毒素并用作生物农药防治虫害，取得了积极的效果，但是该抗体与昆虫BBMV结合能力不高，杀虫效果不甚理想。

实际上，基因工程抗体常常存在亲和力低的问题，实践中通常采用易错PCR技术以提高抗体亲和力，但是随机突变的氨基酸大部分并不能落在影响亲和力的关键氨基酸残基上，这种突变存在一定的盲目性，成功率较低（Kobayash et al.，2010）。基于计算机分子模拟为基础的定点突变是则是更为理性的突变方法，其在已知蛋白三维结构及功能等方面信息的基础上，可以预测分子间结合区域并确定关键氨基酸残基（Qiao et al.，2013），关键氨基酸的有利突变可以提高抗体的亲和力，在体外通过定点突变等基因工程手段可以构建限定性突变抗体库，进而筛选到高亲和力的抗体（Sheedy et al.,2008）。

随着对抗体结构与功能关系的认知不断加深，借助计算机模拟技术进行抗体改造可以在限定范围内有目的地引入突变，对不利于抗体-抗原结合的氨基酸位点进行设计与定向改造，Wong 等（1995）在已知抗原-抗体复合物三维结构的基础上，对抗苯偶氮基胂酸酯（anti-p-azophenylarsonate）Fab 重链108 位上的Phe定点突变为Trp之后,相对野生抗体而言，突变体亲和力就提高了10 倍；Farady等（2009）采用同源建模、分子对接等方法将II型跨膜丝氨酸蛋白酶（matriptase，又名epithin）的抗体E2重链CDR3区98位氨基酸由Thr到Arg突变产生了大量的自由能变化，接下来的实验证实突变将亲和力提高了14倍，达到了240 pM；Zhang等（2013）在构建了抗成纤维细胞活化蛋白单链抗体E3突变库的前提下，对CDR区进行了有目的地定点突变，其中效果最好的突变为将单链抗体E3的重链33位氨基酸Asp变为Gly，107位Tyr变为His,此E3 Mut2比野生型E3亲和力提高了4倍，这些定点突变的氨基酸几乎都分布在抗原抗体结合区域内，对抗体CDR区一些结构产生微小的变化，使得抗体和抗原结合区域的互补性更趋完善（Cauerhff et al.,2004）。为进一步对抗体分子结合区域改造指明了方向，目前结合定点突变来筛选抗Cry1B毒素独特型单链抗体的方法尚未见报道。

发明内容

针对上述问题，本发明提供一种人源杀虫蛋白及其制备方法与应用，该人源杀虫蛋白是通过对C7定向突变后筛选获得，与稻纵卷叶螟(Cnaphalocrocis medinalisGuenee)中肠BBMV具有较高的亲和力，本发明是这样实现的：

一种人源杀虫蛋白，其编码核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。