[发明专利]哺乳动物双基因高效筛选表达载体及其构建方法

说明书

本发明涉及生物制药技术领域，具体公开了哺乳动物双基因高效筛选表达载体及其构建方法；本发明涉及哺乳动物双基因高效筛选表达载体pGD、pGN，载体pGD携带GS和DHFR筛选基因，载体pGN携带GS和NEO筛选基因，同时在筛选基因前的SV40启动子中引入了缺失突变，实现筛选基因的转录弱化，而且所述载体与带有强启动子pEF‑1α的目的基因表达元件相连接，可快速筛选出高效表达目的蛋白的细胞株，为哺乳动物细胞中制备重组蛋白提供了新的工具。所述载体筛选高表达单克隆细胞,具有速度快、阳性克隆率高、目的蛋白表达量高等特点。

技术领域

本发明涉及生物制药技术领域，具体涉及到哺乳动物双基因高效筛选表达载体及其构建方法。

背景技术

基因工程药物因具有其他药物无法比拟的优点，迅速成为制药产业中引人注目的焦点,近年来，各国政府将其视为新的经济增长热点并大力支持。CHO细胞(Chinesehamster ovary,中国仓鼠卵巢细胞)表达系统是目前应用最广泛的真核表达系统之一，被广泛应用于抗体类蛋白质药物的生产。影响重组蛋白在CHO细胞中表达的因素很多，涉及CHO细胞表达体系、表达载体系统、外源基因、表达细胞株的加压扩增与筛选、细胞大规模培养等。CHO细胞表达体系和外源基因影响mRNA(Messenger RNA)的翻译；表达细胞株的加压扩增,目的在于增加外源基因的拷贝数,从而提高表达量；筛选基因的应用使获得稳定的、高表达的单克隆细胞株成为可能[吴海涛，胡云龙，陈松，等，中国生物工程杂志，2004；24(8)：1-5]。构建哺乳动物高效筛选表达载体，是哺乳动物细胞株生产制药的重要研究内容。

为了获得高效表达的细胞株，需要用携带筛选基因和目的基因的载体，转染哺乳动物细胞，并使载体随机整合到细胞基因组中，通过加压筛选，获得稳定表达的细胞株。真核细胞的筛选基因主要包括两类：一类是新霉素磷酸转移酶(neomycinphosphotransferase,NEO)等非扩增基因，它不影响目的基因的拷贝数；另一类是共扩增基因，如二氢叶酸还原酶(Dihydrcofolate reductase，DHFR)基因、谷氨酰胺合成酶(Glutamine synthetase，GS)基因等。G418是一种氨基糖苷类抗生素，通过影响核糖体的功能阻断蛋白质的合成，当NEO基因整合到基因组后，NEO基因编码的抗性产物新霉素磷酸转移酶，可以将G418转变成无毒形式，从而使细胞在含G418的培养基中生长。叶酸类似物氨甲喋呤(Methotrexate，MTX)能抑制二氢叶酸还原酶DHFR活性，导致无法合成四氢叶酸，将携带目的基因和DHFR基因的质粒转染DHFR缺乏的细胞，在MTX选择压力下，幸存下来的细胞的DHFR基因得以扩增，带动目的基因的扩增[Looney JE，Hamlin JL.Mol cell Biol，1987；7(2)：569-577]。然而，在选择压力下，DHFR临近基因的扩增大小和范围是处于变化中的，扩增不稳定。谷氨酰胺合成酶扩增系统是新近发展起来的，当细胞在缺乏谷氨酰胺、加入谷氨酰胺合成酶抑制物(Methionine sulphoximine，MSX)的条件下培养，GS基因不仅自身进行自我复制，还能够带动外源基因随着GS基因的复制而复制，达到目的基因的高水平表达[Bebbington CR，Renner G，Thomson S，et al，Biotechnology，1992；10(2)：169-175]，谷氨酰胺合成酶扩增系统具有更高的扩增效率，但是筛选到的细胞生长状态不佳。