[发明专利]哺乳动物双基因高效筛选表达载体及其构建方法有效
| 申请号： | 201510313438.X | 申请日： | 2015-06-09 |
| 公开（公告）号： | CN104946687B | 公开（公告）日： | 2018-09-14 |
| 发明（设计）人： | 周海平;李红英;昝琰璐;王浛;卢薇;白义;白先宏 | 申请（专利权）人： | 北京东方百泰生物科技有限公司;北京精益泰翔技术发展有限公司 |
| 主分类号： | C12N15/85 | 分类号： | C12N15/85 |
| 代理公司： | 暂无信息 | 代理人： | 暂无信息 |
| 地址： | 100176 北京市大兴区北*** | 国省代码： | 北京;11 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 哺乳动物 基因 高效 筛选 表达 载体 及其 构建 方法 | ||
1.哺乳动物双基因高效筛选表达载体，其特征在于：包含载体pGD和载体pGN，所述载体pGD和所述载体pGN均包含双筛选基因，所述载体pGD的双筛选基因包括谷氨酰胺合成酶GS基因和二氢叶酸还原酶DHFR基因；所述载体pGN的双筛选基因包括谷氨酰胺合成酶GS筛选基因和新霉素磷酸转移酶NEO基因；所述双筛选基因的启动子均采用缺失突变SV40启动子的方法进行了弱化，所述SV40启动子去掉了sphⅠ间的72bp重复序列，去掉的重复序列如SEQID No.1；所述双筛选基因的目的基因表达框均含有强启动子；所述强启动子采用pEF-1α强启动子启动外源基因的表达。
2.根据权利要求1所述的哺乳动物双基因高效筛选表达载体，其特征在于：所述筛选标记包含弱化的SV40启动子控制的GS基因、DHFR基因或NEO基因。
3.根据权利要求1所述的哺乳动物双基因高效筛选表达载体，其特征在于：所述目的基因表达框依次含有EF-1α强启动子、目的基因以及polyA多聚腺苷酸尾巴序列。
4.根据权利要求1-3任一所述的哺乳动物双基因高效筛选表达载体，其特征在于：所述哺乳动物双基因高效筛选表达载体，其构建方法包括：
(1)以含有谷氨酰胺合成酶GS基因的哺乳动物表达载体pBHHU、含有二氢叶酸还原酶DHFR基因的哺乳动物表达载体pSV2-DHFR和含有新霉素磷酸转移酶NEO基因的哺乳动物表达载体pEF1/myc-hisB为基础载体，以即用型阳性选择克隆载体pZeroback为辅助载体，构建独立的筛选基因载体；
(2)将DHFR筛选基因或NEO筛选基因的表达框分别与含有弱化了SV40启动子的GS筛选基因连接，构建含有双筛选基因的表达载体pGD或载体pGN。
5.根据权利要求4所述的哺乳动物双基因高效筛选表达载体，其特征在于：所述哺乳动物双基因高效筛选表达载体pGD或载体pGN的应用，将双基因高效筛选表达载体pGD或载体pGN，与带有强启动子的外源目的基因连接，其过程包括：
(1)将目的基因插入到带有pEF1α强启动子的载体pEF1/myc-hisB的多克隆位点；
(2)将目的基因的高表达载体与筛选载体pGD或载体pGN连接。
6.根据权利要求4所述的哺乳动物双基因高效筛选表达载体，其特征在于：所述哺乳动物双基因高效筛选表达载体用于单基因或双基因的表达载体的构建。
7.根据权利要求4所述的哺乳动物双基因高效筛选表达载体，其特征在于：所述哺乳动物双基因高效筛选表达载体用于包含CHO和NSO的哺乳动物细胞筛选稳定高表达细胞株。
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