[发明专利]用于现场检测多种血清型口蹄疫病毒的引物、探针及试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种应用重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase Ploymerase Amplification，RPA)并结合侧流层析技术(Lateral Flow Assay)现场检测多种血清型口蹄疫病毒的引物、探针及其试剂盒。

背景技术

口蹄疫是由口蹄疫病毒(FMDV)引起的发生在猪、牛、羊等偶蹄类动物上的急性、热性、高度接触性传染病，被世界动物卫生组织列为“A类烈性传染病”，一旦暴发，必须扑杀感染及接触感染的动物，造成巨大的直接经济损失，而且严重危害畜牧业的健康发展以及相关产品的对外贸易，对国家的政治、经济具有深远的影响。口蹄疫病毒有7个血清型和65个以上的血清亚型，血清型之间无交叉免疫现象，因而难以控制。我国为口蹄疫流行国家，主要流行O型、A型和Asia 1型口蹄疫。2005年我国大面积爆发了Asia 1型口蹄疫，2009年和2013年爆发了A型口蹄疫，近年来，均有O型口蹄疫的散发和流行，特别是随着我国养殖业集约化、规模化的迅猛发展，口蹄疫的传播风险也来越大。

目前，病毒的分离与鉴定、PCR及其相关的技术是口蹄疫病毒检测的主要方法，口蹄疫病毒的分离培养要求在生物安全三级以上实验室进行，并需要特殊的仪器设备和专业的技术人员，在分离过程中存在病毒扩散的危险，且耗时长。而PCR及其相关的技术可以检测口蹄疫病毒的核酸，但需要复杂的仪器设备，难以满足非实验室等现场环境下的检测要求。

重组酶等温扩增(recombinase ploymerase amplification,RPA)技术是不同于PCR的核酸检测技术，RPA是在重组酶介导下模拟体内DNA的复制过程。重组酶与引物结合形成蛋白-DNA复合物后，寻找到双链DNA同源序列，在单链DNA结合蛋白的作用下，模板DNA解链，引物与模板DNA配对，并在链置换DNA聚合酶的作用下复制、扩增，单个DNA模板分子得到大约10¹²扩增产物。它与PCR不同，不需要退火反应过程，可在37℃～42℃等温条件下，反应20余分钟即可得到扩增产物(Forget et al.,2012)。RPA可以与侧向流动免疫层析技术相结合，在RPA扩增体系中，需要生物素标记的反向引物和荧光基团标记的探针，在距荧光基团30个碱基处有一个脱碱基位点(dSpacer)，该位点可被nfo核酶识别、切割，产生新的羟基末端，并在DNA聚合酶作用下延伸，形成带有生物素和荧光基团双标记的RPA产物，通过层析膜扩散，被生物素配体和荧光基团标记抗体捕获，形成具有颜色的检测线。该方法检测时间短，5分钟左右就能目测结果，肉眼判读。

但目前对于RPA技术的研究尚处于起步阶段，国内外还没有将RPA技术应用于FMDV检测的报道。本发明系首次采用RPA技术建立快速检测FMDV的方法，并通过特异性和灵敏度评价，可用于临床现场检测，为FMDV的现场检测提供一种灵敏、可靠的新方法。

发明内容

针对RPA技术应用于FMDV检测领域的空白，本发明提供了一种准确、快速、简便的现场检测口蹄疫病毒的RPA检测方法。

为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：

一种用于通过RPA-侧流层析技术检测多种血清型口蹄疫病毒的通用引物和探针组合，其正向引物序列如SEQ ID No.1所示，反向引物序列如SEQ ID No.2所示，探针序列如SEQ ID No.3所示。

正向引物2BF:5’-GTCTCGACGAGGCCAAGCCCTGGTACAAACT-3’；(SEQ ID No.1)

反向引物2BR：5’-【Biotin】CGAGGCGACCTTGACCAACCCGGCCAACAGG-3’；(SEQ ID No.2)

探针序列2BP：5’-【FAM】GTCTTGAGATTCTGGACAGCACTTTTGTCGTG【dSpacer】AAAAGATCTCCGACTCG【C3-spacer】3’；(SEQ ID No.3)。

需要说明的是：与常规PCR反应不同，RPA反应所需引物的长度通常为30-35bp，探针序列的长度为46-52bp，引物设计时为了避免形成引物内部及之间的二级结构，其长度的增加也使引物设计及选择难度的增加，因此，引物的设计和选择对RPA的结果至关重要。RPA技术正处于起步研究阶段，尚无专门的引物、探针设计软件，也没有大量的数据为其引物设计原则提供依据。因此，本发明的引物和探针组合是需要从靶标序列两端设计多对引物进行优化、筛选才能得到。