[发明专利]一种利用超声波处理提取河豚鱼DNA的方法

说明书

技术领域

    本发明涉及一种利用超声波处理提取河豚鱼DNA的方法。

背景技术

动植物材料样品通常采用细胞裂解缓冲液（CTAB、GuSCN或SDS）在65 ℃恒温下振荡温育，进行样品前处理，继而提取DNA，但要想提取的DNA产量高质量好，必须对动植物材料样品在裂解缓冲液温育浸泡较长时间，充分反应，比较费时，通常需要过夜，达不到快速的目的。超声波处理能改善对生物DNA提取效果，提高产量与纯度，但在超声波环境中以CTAB裂解缓冲液65℃温育提取河豚鱼DNA，迄今未见报道。

为提高DNA提取效率，在保证检测结果准确的前提下，缩短DNA提取时间，本发明以河豚鱼肉为实验材料，对影响河豚鱼特异物种成分（Cyt B基因）检测的主要前处理因素，DNA提取过程中的CTAB  (十六烷基三甲基溴化铵，hexadecyltrimethylammonium bromide)裂解缓冲液在65 ℃恒温常规温育与超声波温育处理效果进行比较分析，以期筛选出优化的前处理措施，提高河豚鱼物种PCR鉴别效率，并保证结果的准确性，为建立河豚鱼物种鉴别的快速检测方法提供依据。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用超声波处理提取河豚鱼DNA的方法，发明基于超声波技术的应用，建立一种应用超声波处理的河豚鱼DNA提取方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种利用超声波处理提取河豚鱼DNA的方法，所述方法步骤包括如下：

1）合成引物对；所述引物对为HT-1F：5'-TGCCTCAACTACAAGAACCTAATGG-3'；HT-1R：5'-GGGAAGGACATAGCCCACGA-3'。

2）河豚鱼DNA样品中加入CTAB裂解缓冲液，在功率100%的超声波清洗器中65 ℃恒温温浴处理，处理时间为5 -25 min，各处理重复3次；

3）将获得DNA样品用于PCR扩增，通过PCR产物电泳图谱，鉴定处理的DNA提取结果。

步骤2）具体为：称取100 mg样品于2.0 mL离心管中，加入600 μL 2 % CTAB溶液和蛋白酶K 15 μL，在超声波清洗器中温育处理5 -25 min及在水浴锅中65℃常规温浴过夜处理；在离心管中加入600 μL三氯甲烷，13400 r·min^-1条件下离心15 min，取上清，加入2倍体积的0.5 % CTAB溶液，颠倒混匀，室温静置约1.5 h；在13400 r·min^-1条件下离心25 min，取沉淀，加入400 μL NaCl 溶液，沉淀溶解完全后，加入15 μL Rnase 酶37 ℃条件下温浴约1.5 h；加入等体积的三氯甲烷、饱和酚、异戊醇混合液，颠倒数次充分混合后，在13400 r·min^-1条件下离心15 min，重复此操作三次；取上清，加入0.8倍异丙醇和1/10体积的NaAc溶液，涡旋30 s，充分混合后，在13400 r·min^-1下离心15 min；取沉淀，加入400 μL 70 % 乙醇，上下颠倒使沉淀悬于溶液中，在13400 r·min^-1条件下离心洗涤沉淀10 min；经DNA浓缩仪干燥10 min，加pH 8.0、100 μL TE 在65 ℃条件下溶解15 min，放入4 ℃冰箱保存待用。

所述的三氯甲烷：饱和酚：异戊醇体积比为25：24：1。

本发明设计5个时间段的超声波处理与常规温育过夜（8小时）处理。其中5个超声波处理时间依次为5 min、10 min、15 min、20 min、25 min，均为65 ℃恒温温浴处理，个处理重复3次。数控超声波清洗器（KQ-500DE型，500 W、40KHZ）使用功率为100%。选择在超声波清洗器中温育处理5 min，建立了省时高效的超声波处理DNA提取方法。

本发明的优点在于： 传统的DNA提取过程中的样品CTAB裂解液65 ℃恒温常规温浴处理时间在1-8小时，本方法利用超声波处理65 ℃温育只需5 min，节省时间，大幅度提高DNA提取效率，进而达到快速检测的目的。

附图说明

图1 不同超声波处理时间提取的河豚鱼DNA电泳结果比较。1-5：超声波处理时间依次为5 min、10 min、15 min、20 min、25 min；6：经65 ℃常规温浴过夜处理，M：DNA-Marker。