[发明专利]肿瘤特异性和可热调控的siRNA表达载体及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了肿瘤特异性和可热调控的siRNA表达载体及其制备方法和应用，siRNA表达载体含有由肿瘤特异性启动子和热休克元件调控表达的siRNA表达框，制备方法简单，具有良好的肿瘤特异性，从而可以降低其对正常细胞产生的毒副作用，并且siRNA表达载体在热激的条件下可高效率地敲除目的基因，条件可控，并且避免外源诱导物引起的免疫反应，因此可用于肿瘤靶向治疗，具有很好的应用前景。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及肿瘤特异性和可热调控的siRNA表达载体，还涉及该siRNA表达载体的制备方法和应用。

背景技术

RNAi是在生物进化上高度保守的特异性转录后基因沉默过程，并已经成为强大的基因操作工具。它几乎可以用来研究任何一种基因的分子途径以及表型和基因型之间的关系。但仍存在些许不足之处，如RNAi时间和空间上的不可控性及非靶向性，上述不足严重限制了RNAi在基因治疗领域中的广泛应用。因此，RNAi在时间和空间上的不可控性以及非靶向性是需要亟待解决的难题。诱导型RNAi技术可以通过诱导物介导shRNA的表达进而实现对靶基因的有效调控，因此也成为了近些年RNAi技术的研究热点。目前所存在的诱导型RNAi系统主要包括两大类：一种是利用已经构建成熟的调控系统(例如：Tet-on和Tet-off)，另一种是基于胁迫诱导型Pol II类启动子(如HSP70)。相比较而言，前者成本高，耗时长，调控系统比较复杂，不可控因素较多，其中诱导药物对细胞的毒性较大。而后者可直接在外界因素(如：缺氧、热激和冷激)的刺激下实现对目的基因的调控，操作简单，成本较低，同时对细胞无明显损伤，但是胁迫诱导型Pol II类启动子受外界因素调控，并不具有靶向性，同样不能满足RNAi在基因治疗领域中的应用。

因此，急需一种在时间和空间上可调控的靶向RNAi表达载体，为RNAi在基因治疗领域中应用奠定基础。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供肿瘤特异性和可热调控的siRNA表达载体；本发明的目的之二在于提供肿瘤特异性和可热调控的siRNA表达载体的制备方法；本发明的目的之三在于提供肿瘤特异性和可热调控的siRNA表达载体的应用。

为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

肿瘤特异性和可热调控的siRNA表达载体，所述siRNA表达载体含有由肿瘤特异性启动子和热休克元件调控表达的siRNA表达框。

优选的，所述肿瘤特异性启动子为人端粒酶逆转录酶启动子，其核苷酸序列如SEQID NO.3所示。

优选的，所述热休克元件为HSE(MN)或HSE(XY)，所述HSE(MN)的核苷酸序列如SEQID NO.4所示，所述HSE(XY)的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

优选的，所述siRNA表达框如SEQ ID NO.6所示。

2、所述肿瘤特异性和可热调控的siRNA表达载体的制备方法，包括如下步骤：

a.以SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示序列为引物克隆人端粒酶逆转录酶启动子，然后合成热休克元件，所述热休克元件的核苷酸序列如SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示；

b.将步骤a克隆的人端粒酶逆转录酶启动子和热休克元件替换pMHSP70psil质粒的HSP70启动子，所述热休克元件位于所述人端粒酶逆转录酶启动子的5’端；再将SEQ IDNO.6所示序列连入启动子的3’端，得肿瘤特异性和可热调控的siRNA表达载体。

优选的，步骤a中，克隆人端粒酶逆转录酶启动子的扩增条件为95℃预变性5min；95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存。

3、所述肿瘤特异性和可热调控的siRNA表达载体构建靶向干扰肿瘤治疗基因表达的载体中的应用。