[发明专利]快速低成本制备DNA Ladder的方法

说明书

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域，尤其是一种快速低成本制备DNA Ladder的方法。

背景技术

DNA ladder是一组已知大小和浓度的DNA片段混合样品,可以与未知的DNA样品一起进行凝胶电泳用于初略指示其分子量与浓度，是分子生物学实验常用的试剂耗材之一。

早期的DNA ladder是使用限制性内切酶（如ECORⅠ或者Hind Ш等）酶切λ噬菌体的基因组DNA或猴病毒细菌的质粒DNA片段而获得大小不同的DNA片段。这种方法的人力、物力以及仪器维护成本特别高,并且产生DNA片段的大小常常受到限制性酶切位点的限制，不能人工调控DNA ladder的片段大小和浓度。

PCR能够快速有效地获得大量目标片段，并且在合适的范围（100bp-3000bp）内可通过引物设计高效廉价的获取任意大小的片段，通过将含有目标大小片段构建到pMD18-T载体上，利用载体上的通用引物分别对每个片段进行PCR扩增，DNA ladder的每一个DNA片段再按照设计好浓度进行稀释与混合，最终快速廉价的制备大小、浓度均可控的DNA ladder。

发明内容

本发明的目的是：提供一种快速低成本制备DNA Ladder的方法，它解决了传统酶切方法成本高、获得DNA片段大小与浓度不可控制的难题，以克服现有技术的不足。

本发明是这样实现的：快速低成本制备DNA Ladder的方法，根据DNA Ladder所需要的条带大小，从已知基因组序列中选取目标大小的DNA序列，采用设计好的引物进行PCR进行扩增，切胶回收后将不同大小的条带分别构建到pMD18-T载体，并提取质粒，获得各个片段的模板；测定各纯化后的目的片段的浓度，按照设计好的浓度进行混合与稀释，得到最终DNA ladder。

将每个DNA片段的扩增产物进行纯化具体是：利用pMD18-T载体上的通用引物M13F与M13R，分别对每一个目的片段进行扩增，通过脱盐纯化PCR产物，获得各目的片段，利用10×TE缓冲液溶解, ，可以长期保存。

PCR能够快速有效地获得大量目标片段，并且在合适的范围（100bp-3000bp）内可通过引物设计高效廉价的获取任意大小的片段，

由于采用了以上技术方案，本发明通过PCR扩增的方法获得DNA Ladder所需要的条带，所有条带的大小和浓度都可以精确控制，不受传统方法（如EcoR I 酶切λ DNA）受酶切位点和质粒浓度的限制，生产成本能降低90%；再通过将含有目标大小片段构建到pMD18-T载体上，利用载体上的通用引物分别对每个片段进行PCR扩增，DNA ladder的每一个DNA片段再按照设计好浓度进行稀释与混合，最终快速廉价的制备大小、浓度均可控的DNA ladder。解决了传统酶切方法成本高、获得DNA片段大小与浓度不可控制的难题。而采用本发明方法制造的DNA ladder清晰度与指示效果与商用DNA ladder基本相当，可以代替商用DNA ladder使用。本发明方法简单，易于实施，成本低廉，使用效果好。

附图说明，

图1为本发明的流程示意图；

图2为本发明的制备DNA ladder与商用DNA ladder的对比图。

具体实施方式，

本发明的实施例：快速低成本制备DNA Ladder的方法

步骤一、T100～T3000模板的克隆与构建

在Tair数据库中检索挑选合适长度的DNA序列，设计扩增引物，以拟南芥幼嫩花cDNA为模板进行PCR 扩增，从拟南芥基因组中克隆3000bp、2000bp、1500 bp、1000 bp、750 bp、500 bp、300 bp、100bp的DNA片段，引物组合依次为（DLF+3000R，DLF+2000R，DLF+1000R，DLF+750R，DLF+500R，DLF+300R，DLF+100R）其对应扩增引物序列见序列表，并分别构建到pMD8-T载体，分别命名为T-100～T3000；挑选出阳性克隆，并用质粒提取试剂盒（上海生工）制备阳性质粒，具体操作参考示意图1，序列信息见序列表。

步骤二、T100～T3000快速扩增与纯化

采用pMD8-T载体上公用引物M13F和M13R分别对T100～T3000的进行扩增，采用氯仿乙醇纯化方法进行脱盐处理，用10×TE buffer溶解，获得浓度大、纯度高可以长期保存的各个DNA目的片段。

(1)配置PCR反应混合物（上海生工 2×Taq PCR反应试剂盒）：

2×Taq PCR Mixture        10μl