[发明专利]一种增强D-苯基乳酸产量的D-LDH-FDH融合基因的构建与表达

说明书

本发明涉及一种增强D‑苯基乳酸产量的D‑LDH‑FDH融合基因的cDNA序列，由D‑LDH基因、连接肽的DNA序列和FDH基因串联而成。本发明还提供了该融合基因的构建方法以及表达方法。本发明将乳酸脱氢酶和甲酸脱氢酶通过连接肽串联得到融合蛋白，该蛋白在大肠杆菌中表达后，保持了两种酶的活性，并且融合蛋白中的乳酸脱氢酶的酶活性较单独表达时高，较乳酸脱氢酶，甲酸脱氢酶在同一细胞内分开表达时高，催化苯丙酮酸转化成苯基乳酸时表现出更强的催化效果。

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种增强D-苯基乳酸产量的D-LDH-FDH融合基因的构建与表达。

背景技术

苯基乳酸(phenyllactic acid,PLA)，即2-羟基-3-苯基丙酸，是一种新型的生物防腐剂，它具有抗革兰氏阳性菌、阴性菌和真菌等功能。此外，苯基乳酸还是中药提取物“丹参素”的类似物，具有一定的药用价值。因此苯基乳酸的开发和利用具有广泛的应用前景。目前，苯乳酸主要由化学合成或微生物转化两种方式获得，化学合成法在不同程度上存在污染环境、技术复杂、条件苛刻、副产物多等缺陷。因此，研究人员将研究方向转向了生物合成法。近几年用于苯乳酸研究的微生物主要有白地霉、丙酸菌、乳酸菌、芽孢杆菌等。2000年，LAVERMICOCCA P等首次报道从酸面团中分离到的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)21B，苯乳酸产量达到56.44mg/L。随后研究相继获得多株产苯乳酸的乳酸菌，但菌株间产量差异较大，且苯乳酸产量相对都较低。

乳酸脱氢酶是自然界微生物细胞内转化苯丙酮酸生成苯基乳酸的关键酶，但由于该酶催化过程中需要消耗体系中的还原型辅酶，还原型辅酶的额外添加使反应成本显著增加。因此开发系统中还原型辅酶再生的方法亦是研究的关键。近年来，甲酸脱氢酶在辅酶再生中的应用已成为辅酶酶法再生研究领域的热点之一，甲酸脱氢酶体系是最成功的再生体系。因此，如果能在乳酸脱氢酶催化苯丙酮酸转化生成苯基乳酸的同时，结合甲酸脱氢酶应用于辅酶NADH的酶耦联法再生系统，可能能够大幅度提高苯乳酸产量。流程示意如下：

发明内容

本发明的第一目的是提供一种增强D-苯基乳酸产量的D-LDH-FDH融合基因的cDNA序列。

本发明的第二目的是提供上述cDNA序列的构建方法。

本发明的第三目的是提供包含上述cDNA序列的载体。

本发明的第四目的是提供包含载体的宿主细胞。

本发明的第五目的是提供上述cDNA序列的表达方法。

本发明通过以下技术方案来实现：

一、一种增强D-苯基乳酸产量的D-LDH-FDH融合基因的cDNA序列，由D-LDH基因、连接肽的DNA序列和FDH基因串联而成，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，编码SEQ ID No.2所示的氨基酸序列，以及经过取代、缺失或者叠加一个或几个氨基酸衍生的蛋白质。

所述乙酸脱氢酶来自于植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，所述甲酸脱氢酶来自于博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)。

进一步的，所述的核苷酸序列中1-996来自D-LDH基因，序列996bp；997-1041bp为连接肽的DNA序列，共45bp；1042-2133bp来自FDH基因，序列1092bp。

进一步的，所述的连接肽的DNA序列如SEQ ID No.3所示，编码的氨基酸序列如SEQID No.4所示，包括12个甘氨酸和3个丝氨酸。

二、上述的cDNA序列的构建方法，该方法包括以下步骤：

(1)设计PCR引物，使D-LDH的下游引物和FDH的上游引物具有一段重叠互补区域；