[发明专利]一种定点突变改造的基因工程酪氨酸酶

说明书

本发明涉及通过基因工程改造获得的链霉菌酪氨酸酶。本发明所述的一种定点突变改造的基因工程酪氨酸酶，其特征在于所述定点突变的基因工程链霉菌酪氨酸酶氨基酸序列相对于天然的链霉菌酪氨酸酶氨基酸序列的第7位谷氨酰胺突变为赖氨酸，第234位甘氨酸突变为脯氨酸。本发明所述的基因工程链霉菌酪氨酸酶最适温度相对于天然的链霉菌酪氨酸酶提高了10℃，在60℃下的半衰期提高了3倍，为其高效合成黑色素奠定了基础。

技术领域

本发明涉及一种热稳定性及最适作用温度提高的酪氨酸酶突变体，属于基因工程技术领域。

技术背景

酪氨酸酶(Tyrosinase,EC 1.14.18.1)是一种含有双铜离子的金属酶。酪氨酸酶是多功能酶，在氧气的参与下可以催化单酚生成二元酚(一元酚酶活性)；催化二元酚生成相应的醌(二元酚酶活性)。而醌在经过一系列酶催化及非酶催化的氧化还原反应后最终生成黑色素。酪氨酸酶广泛的存在于动植物及微生物中。一般认为人类的毛发、眼睛、皮肤上的颜色都是由酪氨酸酶决定的，因而大多数化妆品行业通过研究酪氨酸酶酶抑制剂来开发美白产品。人体内如果酪氨酸酶代谢异常将会导致一系列疾病的发生，例如白癜风和白化病等。同时禽类的羽毛，及昆虫甲壳的颜色也酪氨酸酶相关，它的产物黑色素可以与蛋白交联结合成坚硬的支架，起到保护作用。在植物体内，酪氨酸酶可以催化生成一些对人体有益的物质，例如茶多酚。此外，水果表面受损时的褐变也与酪氨酸酶相关，食品行业研究开发酪氨酸酶抑制剂来保鲜水果。此外，酪氨酸酶在工业上也有重要的应用。首先，酪氨酸酶可以催化酪氨酸合成左旋多巴等有益的酚类物质，左旋多巴是效果良好的抗颠麻痹药，已经被广泛的应用于临床。此外，酪氨酸酶还可以用于制备生物传感器，用来检测环境中酚类化合物的浓度。由于工业污染，导致大量的酚类化合物被排放到自然环境中(主要是水源)，导致严重的污染，而大部分酚类化合物对人体有毒害作用，而酪氨酸酶由于底物的广谱性，大部分的酚类化合物均可以被酪氨酸酶催化，因此，酪氨酸酶还可以被用来清除污染环境中的酚类化合物。当然，酪氨酸酶还以用来制备黑色素。

黑色素广泛存在于动植物和微生物中，与生物自我保护机制有关。有研究表明，天然的黑素色具有紫外吸收、抗氧化、清除自由基、螯合阳离子(例如有毒的重金属)、新型的药物载体、作为治疗某些与黑色素缺乏相关的神经系统疾病，例如着色性干皮病、帕金森氏症、老年性痴呆症、亨廷氏舞蹈病等，有报道指出，可溶性的黑色素在体外具有抗HIV的活性，为治疗艾滋病开辟了一个新途径。目前黑色素生产主要为动植物提取和采用化学法以酪氨酸为原料生产，这两种方法成本高、工艺繁琐，使黑色素因价格昂贵而限制其大规模的生产与应用。微生物所产的黑色素是由其体内的酪氨酸酶催化酪氨酸形成的多巴类黑色素，是氨基酸的衍生物，具有无毒、无害等特点，而且产黑色素的微生物种类繁多，生产工艺简单，易于操作，不受时间与地域的限制，因此用微生物来生产黑色素具有巨大的优势。

Streptomyces kathirae SC-1是本实验室前期筛选获得的一株高产黑色素菌株(保藏编号为：CCTCC M 2012432，专利申请公布号：CN104403975A)，对S.kathirae SC-1发酵产黑色素条件进行了优化，发现该菌株具有极高的黑色素生产潜力，但发现酪氨酸酶的稳定性较低，导致黑色素发酵后劲不足，严重限制黑色素的产量。因此需要提高酪氨酸酶的稳定性。

定点突变是提高酶稳定性的重要手段之一。与其他提高酶稳定性的策略相比，定点突变更迅速，直接并且节约成本。而随着生物信息学的发展，很多预测软件被研究开发出来用来辅助定点突变，使定点突变得到正突变的效率明显提高。本发明基于已得到的酪氨酸酶在大肠杆菌中的表达平台，利用以计算机模拟为基础的定点突变技术，对酪氨酸酶进行分子改造，获得稳定性显著提高的酪氨酸酶。

发明内容

本发明的目的在于，通过对酪氨酸酶进行分子改造，使改造后的酪氨酸酶在稳定性方面有所提高，最终应用于黑色素的生产。