[发明专利]一种伊沙匹隆的半合成制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种伊沙匹隆的生产方法，具体地说涉及一种通过粘细菌中纤维堆囊菌发酵生产埃博霉素D，然后以其为起始原料，通过半合成方法产生伊沙匹隆的方法。

背景技术

埃博霉素(epothilones)是由黏细菌纤维素堆囊菌分泌的结构为16元内酯大环为中心体，噻唑环配基为侧链的一类细胞毒性化合物，是一种具有类似紫杉醇微管蛋白聚合和微管稳定作用的新抗肿瘤药物。埃博霉素A和B是在20世纪90年代由及其同事最先从南非Zambesi河岸的泥土中找到一种黏细菌纤维素堆囊菌Sorangium cellulosum(Myxococcales)菌株So ce90，从其培养物中分离提取了一种具有抗癌活性的化合物，埃博霉素A、B、C、D结构如下：

埃博霉素是一种具有类似紫杉醇的促微管蛋白聚合特性、结构新颖的抗肿瘤化合物。埃博黴素目前被世界上公认为21世纪将取代紫杉醇的最有效的抗癌药物。与紫杉醇比较，埃博霉素水溶性好，注射、口服均可：结构简单，有利于化学合成及衍生化：埃博霉素在P-糖蛋白表达型的多药耐药性(MDR)细胞中也维持很大的细胞毒性，约为紫杉醇的2000-5000倍。

目前，已有六种埃博霉素类化合物进入了临床试验：他们是Ixepa(Ixabepilone)、埃博霉素B、ABJ879、埃博霉素D、KOS-1584、ZK-Epo。其中施贵宝公司的Ixabelilone于2007年10月16日被FDA批准作为一线乳癌的治疗药物。Ixabelilone实际上是一种Aza-epothilone B，即埃博霉素B内酰胺衍生物。它是由纤维堆囊菌So ce90(DSM6773)经UV诱变得到So ce90B2菌株，然后再经亚硝基胍(NTG)诱变育种，得到一株高产菌株SC16408，发酵得到埃博霉素B。然后，以发酵产物埃博霉素B为起始原料转化为伊沙匹隆。阎家麒(CN1554659)曾以全合成埃博霉素B为原料，采用区域性和立体选择性钯催化大环内酯氮化反应，促使埃博霉素B开环，得到一种氮酸，再经三苯磷处理，生成亚氨基正膦，经氢氧化铵水解成为氨基酸。最后用二苯基磷酰叠氮化物(DPPA)和固体碳酸氢钠促进氨基酸环化反应，得到标的的伊沙匹隆。

微生物发酵方法生产埃博霉素的产量都很低，只有原始文献(Gerth et al，The Journal of Antibiotics，1996，49：560)埃博霉素A和B产率分别为22和11mg/L。但是，其后许多文献重复发酵方法，均未得到该产率。即使经诱变选育的“高产菌株”实际也只有埃博霉素A 1.0-6.0mg/L和埃博霉素B 0.5-3.0mg/L。邱荣国(CN1629283)采用UV诱变育种方法，获得了一种以埃博霉素D为主要代谢产物的新菌株S.cellulosum BGS4。获得的新菌株由于缺乏EpoK氧化酶功能，在其他条件相同的情况下，该类菌株只产生埃博霉素C和D，而不产生埃博霉素A和B。

目前，缺乏一种高产埃博霉素D的生物合成方法，尤其是适用于工业规模生产埃博霉素D的实用技术，进而以其为起始材料，采用简易的半合成方法，制造抗癌药物伊沙匹隆。

发明内容

黏细菌的纤维素堆囊菌原始菌株目标产物产率低，采用物理或化学方法诱变育种，所得到的菌株生产能力仍然不理想。在埃博霉素生物合成中，影响基因突变的因素很多。

纤维素堆囊菌So oe90与埃博霉素生物合成有关的基因簇进行的筛选和全测序，获得了埃博霉素合成酶基因的全部序列。埃博霉素生物合酶全长约56kb，是聚酮合酶/非核糖体肽合成酶的杂合体基因簇，即同时含有I型聚酮合酶(PKS)模版和非核糖体肽合成酶(NRPS)。埃博霉素生物合成酶依照转录顺序顺序依次是epoA(1个负载模版)→epoP(1个NRPS模版)→epoB(1个PKS模版)→epoC(4个PKS模版)→epoD(2个PKS模版)→epoE(1个PKS模版)→epoF(环氧酶P450)，这些基因的转录方向一致，同时由于epoA/epoP、epoB/epoC中存在基因的重叠现象，推测epoA/epoP、epoB/epoC可能共转录。而在epoP/epoB(147bp)，epoD/epoE(15bp)和epoE/epoF(115bp)基因之间短小的间区序列中没有发现转录终止子，这表明所有这些基因可能是有一个异常大的操纵子(≥56kb)构成。根据同位素¹³C标记实验结果和合成酶全基因簇功能的推测，埃博霉素的生物合成包括5个阶段：