[发明专利]一种利用CRISPR/Cas9制备CAR-T细胞的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用CRISPR/Cas9制备CAR-T细胞的方法，属于生物学领域。

背景技术

免疫系统是人体的防御体系，一方面发挥着清除细菌、病毒、外来异物的功能，另一方面消除体内衰老细胞以及发生突变的细胞，有的突变细胞会变成癌细胞。机体免疫系统和癌细胞相互作用的结果决定了癌症的最终演变。对于健康的人来说，其免疫系统的强大足以及时清除体内因突变产生的癌细胞。但对于癌细胞病人来说，普遍存在免疫系统低下、不能有效地识别、杀灭癌症细胞；另一方面，癌症细胞大量增殖，会进一步抑制患者的免疫功能，而且，癌症细胞有多种机制来逃脱免疫细胞的识别与杀伤，癌症的免疫治疗就是借助分子生物学技术和细胞工程技术，提高癌症的免疫原性，给机体补充足够数量的功能正常的免疫细胞和相关分子，激发和增强机体抗瘤免疫应答，提高癌症对机体抗癌症免疫效应的敏感性，在体内、外诱导癌症特异性和非特异性效应细胞和分子，达到最终清除癌症的目的。癌症免疫治疗正是通过人为的干预，来调动机体自身的免疫系统对癌细胞进行杀灭和抑制其增殖。

肿瘤免疫治疗技术主要包括利用CTL细胞、DC瘤苗、CIK细胞、DC-CIK细胞、NK细胞、TIL细胞、TCR细胞和CAR-T细胞等进行治疗。最近一两年，从中脱颖而出的是CAR-T细胞治疗。该疗法通过分离患者外周血液中的免疫T细胞，在体外无菌培养，然后经过基因工程改造，也就是根据患者所患的肿瘤类型进行特异性的基因修饰和体外扩增，最后回输患者的体内，达到杀死肿瘤细胞的目的(Figueroa JA et al,Int Rev Immunol 2015,34(2):154-87)。

目前，欧美及亚洲各国都在积极开展CAR-T疗法的临床试验，包括美国、英国、瑞典、中国、日本等。其中，美国开展临床试验项目最多、达41项，占据了全球CAR-T疗法临床试验的74.5％。宾夕法尼亚大学医院、费城儿童医院、美国癌症研究院(NCI)、Fred Hutchinson癌症研究中心、纪念斯隆凯特琳癌症中心和西雅图儿童医院等是最早开展CAR-T细胞疗法的研究机构。中国在CAR-T疗法领域起步较晚，目前仅北京大学肿瘤医院和解放军总医院(301医院)、四川华西医院在开展相关临床试验而且临床目前仅限于白血病，实体肿瘤CAR-T治疗鲜有报道。新兴生物制药公司如Juno、Kite、Celgene、Cellectis、Bluebird，传统制药公司如诺华、葛兰素史克、辉瑞、强生等都投入到了CAR-T疗法的研发中，推动这一极具前景的疗法尽早进入到临床，从而造福癌症及肿瘤患者。

(A service of the U.S.National Institute of Health.http://clinicaltrials.gov)。

虽然许多机构都在进行CAR-T疗法的研究，但目前并没有统一的标准，他们在CAR设计、培养技术、淋巴细胞去除方法以及所治疗的疾病等方面都有不同。如美国国家癌症研究院(NCI)使用的是靶向CD19含CD28共刺激域的第二代CAR，且通过逆转录病毒进行基因转导，使用OKT3和IL2扩增，治疗疾病是非霍奇金淋巴瘤，而宾夕法尼亚大学研究人员使用的是加入4-1BB共刺激分子的第二代CAR，使用抗-CD3/CD28扩增，通过慢病毒载体转导，治疗疾病是ALL和CLL(Mazzarella L.2013American Society of Haematology meeting[J]2014,8:390)。

CAR-T细胞疗法在晚期难治性白血病和淋巴瘤患者中进行的早期临床试验已经显示出非常振奋人心的结果。宾夕法尼亚大学研究人员今年10月在世界顶尖医学杂志《新英格兰医学杂志》上发表的一项临床试验结果显示，在接受了CTL019输注(靶向CD19抗原的CAR-T疗法)的30名复发性或难治性ALL受试者中，治疗后1个月有27名患者获得完全缓解，其中甚至包括15位已经接受过骨髓干细胞移植的患者。6个月时无反复生存率为67％(20人)，总体生存率为78％(23人)。另外还有1名患者2年随访时仍然持续完全缓解(Grupp SA et al,N Engl J Med 2013,368(16):1509-18)。