[发明专利]检测无乳链球菌的引物、试剂盒和方法

说明书

技术领域

本发明涉及微生物的检测方法，特别是涉及检测无乳链球菌的引物、试剂盒和方法。

背景技术

无乳链球菌(Streptococcus agalactiae，Sa)，是一种β溶血链球菌，寄居于人的下消化道及泌尿生殖道。在成年女性的阴道和直肠内有15％-40％可以检测出无乳链球菌，北京协和医院分析2001-2009年女性生殖道细菌的分布情况，发现无乳链球菌成为除大肠埃希菌外，最常见的生殖道细菌，导致这类女性分娩的新生儿感染该菌的比例会比较高。

邓江红等对北京儿童医院234例死亡新生儿的肺组织石蜡标本进行了无乳链球菌检测，其检出率为65％，指出无乳链球菌是新生儿肺炎死亡的主要病原菌。其他相关研究也提出无乳链球菌是导致母婴感染的重要菌。

因此，找到一种简单、快速、经济的无乳链球菌检测方法，成为当前研究的热点之一。

目前无乳链球菌的研究多用PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测结果，存在耗时长，灵敏度低等缺点；目前临床上应用的恒温扩增大多数采用肉眼根据浊度判断结果，导致假阴性率高；而且不同反应管之间可能有气溶胶污染造成假阳性等缺陷。

随着人们对于分子生物领域的不断深入研究，一种全新的核酸扩增技术——环介导等温扩增技术(Loop mediated isothermal amplification，Lamp)越来越受到研究人员的亲睐。该方法是在2000年由日本学者Notomi等首先提出，其特点是针对靶基因的6个独立区域设计两对特异引物，在链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)的作用下，恒温水浴(60～65℃)30～60min可将原有几个拷贝的靶核酸扩增到10⁹水平。

目前国内尚未有实时荧光环介导恒温扩增(Real-Time fluorescence Loop-Mediated Isothermal Amplification,Rea-Lamp)检测无乳链球菌的相关研究。

发明内容

基于此，本发明的目的之一提供一种实时荧光环介导恒温扩增法检测无乳链球菌的试剂盒。

实现上述目的的技术方案如下。

一种实时荧光环介导恒温扩增法检测无乳链球菌的试剂盒，包括有序列组成为SEQID.NO.1-2的内引物，序列组成为SEQID.NO.3-4的外引物，序列组成为SEQID.NO.5-6的环引物。

在其中一个实施例中，还包括有荧光染料，

本发明的另一个目的是提供一种检测无乳链球菌的引物。

实现上述目的的技术方案如下。

一种检测无乳链球菌的引物，包括有序列组成为SEQID.NO.1-2的内引物，序列组成为SEQID.NO.3-4的外引物，序列组成为SEQID.NO.5-6的环引物。

本发明的另一个目的是提供一种检测无乳链球菌的方法。

实现上述目的的技术方案如下。

一种检测无乳链球菌的方法，采用权利要求1-2任一项所述的试剂盒，包括以下步骤：

(1)提取待检测样品的基因组；

(2)加样和加荧光染料后，进行环介导恒温扩增；

(3)检测扩增产物。

在其中一个实施例中，所述内引物、外引物和环引物在扩增的反应体系中的浓度分别为1.6UM、0.2UM、0.8UM。

本发明具有以下优点：本发明针对无乳链球菌的fbsB基因设计筛选得到的特异性的LAMP引物，对无乳链球菌的靶标基因具有很好的扩增效率。对非无乳链球菌进行Rea-Lamp的扩增，均未出现非特异性的扩增，说明该引物对无乳链球菌有较好的扩增能力。而且，本发明所述的实时荧光环介导恒温扩增法检测无乳链球菌的试剂盒灵敏度高，扩增引物对纯培养物中的无乳链球菌的灵敏度可达到300pg/ul。进行重复性试验，结果显示具有很好的重复性。本发明所述的实时荧光环介导恒温扩增法检测无乳链球菌的试剂盒即检测方法具有特异性强、灵敏度高、操作简单、快捷、便于批量检测等特点，为无乳链球菌的检测提供了新的发展方向。

附图说明

图1为实施例2中的Rea-Lamp反应条件。

图2为实施例2中的Rea-Lamp扩增曲线。

图3为实施例3中Rea-Lamp引物特异性的实验结果示意图。

图4为实施例4中的Rea-Lamp引物敏感性的实验结果示意图。

图5为实施例4的溶解曲线图。