[发明专利]一种检测甜瓜黄斑病毒的特异性RT-LAMP引物组及其RT-LAMP检测试剂盒和RT-LAMP检测方法

说明书

技术领域

本发明属于有害生物分子诊断领域，具体涉及一种检测甜瓜黄斑病毒的特异性RT-LAMP引物组及其RT-LAMP检测试剂盒和RT-LAMP检测方法。

背景技术

甜瓜黄斑病毒(Melon yellow spot virus，MYSV)属于布尼亚病毒科，斑萎病毒属，最早是1992年在日本报导发生。该病毒主要侵染西瓜、甜瓜、黄瓜、苦瓜等重要葫芦科作物，能通过多种蓟马传播，球序卷耳、宝盖草、肾子草等杂草是该病毒的中间载体。在近十年，日本、中国、泰国、荷兰、厄瓜多尔等各地都有报导发生，对当地的葫芦科作物的生产造成严重影响，经济损失严重。该病毒2009年在我国的广东、海南、广西等地相继被发现，主要侵染西瓜和甜瓜，发病率为30～100％。2013年，在上海奉贤区的部分黄瓜植株上，我们也发现MYSV病毒的发生，发病率约为10％。2014年，在上海嘉定、浦东等甜瓜种植区，我们也发现MYSV在部分甜瓜和哈蜜瓜品种上发生严重，发病率50～80％。该病毒的全球蔓延和爆发，给当地的葫芦科作物生产造成了极大的损失，成为葫芦科作物生产的重要威胁因子之一。

目前针对MYSV的检测方法主要有电镜观察法、分子生物学方法、血清学方法，但这些方法都需要昂贵的仪器和繁琐的操作。环介导恒温核酸扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是Notomi等2000年发明的一种新型的DNA扩增技术，该方法不需要如RT-PCR长时间的扩增过程和昂贵的PCR仪器及血清学的繁琐的动物实验。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种检测甜瓜黄斑病毒的特异性RT-LAMP引物组及其RT-LAMP检测试剂盒和RT-LAMP(环介导逆转录等温扩增)检测方法，该方法快速、便捷、灵敏、高效、特异性强，克服了目前病毒检测的操作繁琐、成本高、用时长等问题。

本发明根据甜瓜黄斑病毒的S片段的N基因的保守序列设计RT-LAMP检测的引物2对：一对外引物F3，B3和一对内引物FIP，BIP；利用特异性引物，在63～65℃条件下恒温进行RT-LAMP反应，反应60分钟，利用电泳检测或荧光染料技术鉴定出待测样品中是否含有甜瓜黄斑病毒。利用上述方法建立的试剂盒包含LAMP反应液和引物混合液构成的检测体系，该试剂盒可快速、灵敏、特异的检测出甜瓜黄斑病毒。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：

一种检测甜瓜黄斑病毒的特异性RT-LAMP引物组，具体是根据甜瓜黄斑病毒的S片段的N基因的保守序列设计RT-LAMP检测的特异性引物2对：外引物对F3，B3和内引物对FIP，BIP，具体序列如下所示：

F3:5’-CRCTCTGCCCTGTTGTYC-3’；

B3:5’-ACTGGTTGTTCCTGGTTTG-3’；

FIP:5’-CAATTTTGCAGATCTGCTCATATGTTRCCTTTGGCCTATTTYCAG-3’；

BIP:5’-CTCGYGTTATGTCTGCTAGCAATTCAGCCAAGATYTTCACACAA-3’；

其中R代表A或G，Y代表C或T，K代表G或T。

本发明含有所述特异性引物组的检测试剂。

一种含有所述特异性引物组的甜瓜黄斑病毒的RT-LAMP检测试剂盒。

所述RT-LAMP检测试剂盒，还包含RT-LAMP反应液，RT-LAMP反应液和特异性RT-LAMP引物组的混合液组成RT-LAMP检测体系，按总反应体积为20μL为例，反应体系中分别加入：4μL溶液A，4μL溶液B、11μL溶液C和1μL样品总RNA，具体是：