[发明专利]早期矽肺患者血清外泌小体miRNAs检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种职业病检测筛查试剂盒，特别是涉及一种早期矽肺患者血清外泌小体miRNAs检测试剂盒。

背景技术

尘肺病是我国主要的职业病之一，约占职业病总人数的80％。我国矽肺病例占总病例50％，位居第一，是尘肺中危害最严重的一种。目前，矽肺的诊断标准主要依靠影像学，往往在病人出现明显症状时才能诊断出患有矽肺，这时任何药物都无法逆转已发生的肺纤维化病变。因此，寻找快速简便的矽肺早期生物标志物，开展二级预防显得十分必要。

生物标志物的选择条件是快速、简便和稳定，人体外周血血清非常容易获取，血清中外泌小体表达水平不随温度、酸碱性、时间而快速变化。外泌小体是由细胞内多泡体与细胞膜融合后,释放到细胞外基质中的一种直径约30～120nm的膜性囊泡，这些膜性外泌小体在细胞之间穿梭传递重要信息，也会进入血液、唾液、尿液及乳汁等体液中，产生远程调控作用，实验证明，B细胞来源的外泌小体通过整合可与细胞外基质中的胶原-Ⅰ和纤维结合蛋白相结合，表明体内分泌的外泌小体经与细胞外基质相互连接，减少外泌小体的扩散，增加局部浓度，从而提高了外泌小体在局部的生理作用。外泌小体内包含有大量的特定miRNAs和特定蛋白质，带有大量的特定信息在细胞之间来回传递，因此认为选用血清中的外泌小体miRNAs作为生物标志物是可行的。外泌小体的提取一般采取超速离心或化学提取法，超速离心法存在提取费时(需48小时)费力和超离设备条件过高，并且由于过高的转速对操作者的安全构成威胁。单纯化学试剂提取法存在得率偏低等缺陷。miRNAs是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码RNA，其大小长约20～25个核苷酸，通过碱基互补配对的方式识别靶mRNAs，并根据互补程度的不同指导沉默复合体降解靶mRNAs或者阻遏靶mRNAs的翻译。

最近的研究表明miRNAs参与到矽肺发生发展的各个过程，并且已经研究发现了一些特定的miRNAs调控矽肺纤维化的发病机制，比如miR-155、miR-29a。

目前，qPCR技术已经成功应用于多种疾病的miRNAs检测，但尚未见该方法在矽肺病人血清中的外泌小体miRNAs检测方面的应用。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供一种早期矽肺患者血清外泌小体miRNAs检测试剂盒。

本发明的技术方案概述如下：

早期矽肺患者血清外泌小体miRNAs检测试剂盒，包括：血清分装管，外泌小体miRNAs提取试剂盒，外参线虫miR39试剂，逆转录试剂盒，hsa-U6引物，cel-miR-39引物，miRNAs引物试剂盒，qPCR检测试剂盒，无RNA酶的EP管，无水乙醇和ddH₂O，所述miRNAs引物试剂盒包括SEQ ID NO.1所示的miR-16-5p上游引物和SEQ ID NO.2所示的let-7d-5p上游引物。

本发明的优点：

1)本发明的方法可使血清外泌小体的miRNAs提取得率高。梯度离心结合化学试剂提取法可以定量地从体液中提取外泌小体，减少了超高速离心法的危险性和化学法提取得率偏低的风险，为获得外泌小体中的miRNAs带来便利；

2)选用的miRNAs在外泌小体中均为高表达。miR-16-5p、let-7d-5p在血清外泌小体中的表达相对较高，避免了极低表达量难以检测的缺陷。

3)使用本发明的试剂盒鉴定疑似早期矽肺患者具有快速、高效、简便的特点。扩增效率高，灵敏度、特异性高，整个检测反应只需6小时即可完成，操作安全。

本发明的方法、体系可以快速高效地检测到矽肺病人血清中的外泌小体microRNAs，为检测筛选疑似早期矽肺患者提供了新的技术平台，易于推广应用，具有较大的经济、社会效益。

附图说明

图1为早期矽肺患者血清外泌小体miR-16-5p的qPCR溶解曲线。

图2为早期矽肺患者血清外泌小体miR-16-5p的qPCR扩增曲线。

图3为早期矽肺患者血清外泌小体let-7d-5p的qPCR溶解曲线。

图4为早期矽肺患者血清外泌小体let-7d-5p的qPCR扩增曲线。

图5为早期矽肺患者血清外泌小体U6的qPCR扩增曲线。

图6为早期矽肺患者血清外泌小体U6的qPCR溶解曲线。

图7为早期矽肺患者血清外泌小体线虫miR39的qPCR扩增曲线。

图8为早期矽肺患者血清外泌小体线虫miR39的qPCR溶解曲线。