[发明专利]用肿瘤坏死因子受体相关因子6筛选抗肿瘤药物的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种筛选抗肿瘤药物的方法，特别是涉及一种用肿瘤坏死因子受体相关因子6筛选抗肿瘤药物的方法。

背景技术

Akt(也称作蛋白激酶B，PKB)是一个在进化上高度保守的丝苏氨酸蛋白激酶，在人癌中经常高度激活。Akt异常激活意味着肿瘤细胞对于凋亡诱导的耐受，细胞增殖、生长、代谢的异常增加。Akt在绝大多数癌症中存在着过度激活的情况，暗示着Akt的激活在肿瘤发生中的重要角色。关于Akt被活化后是如何被募集到细胞膜上的分子机制，最近，有人报道了肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)是一种E3泛素连接酶，可以泛素化修饰Akt，从而促进Akt转移到细胞膜上，并被激活。

肿瘤，特别是恶性肿瘤的产生严重影响人们的健康，甚至危及人的生命，快速的发现抗肿瘤药物，可以尽可能地减少肿瘤的发生和发展，特别是一些副作用少的抗肿瘤药物，更是目前亟需的。

发明内容

本发明的目的是提供一种用肿瘤坏死因子受体相关因子6筛选抗肿瘤药物的方法。

本发明的技术方案概述如下：

用肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)筛选抗肿瘤药物的方法，包括如下步骤：以SEQ ID NO.1所示的TRAF6作为检测靶点的活性口袋，与天然产物数据库或商用小分子数据库中的小分子，利用AUTODOCK软件进行活性口袋与小分子的对接，分析对接结果，根据打分指标预测小分子与活性口袋的亲和力大小，筛选具有潜在抗肿瘤活性的小分子，通过实验验证小分子的抗肿瘤活性。

所述小分子为奎宁、奎宁丁或辛可宁。

本发明的优点是:

针对在癌症中高表达的激酶，选择令其活化的关键酶，确定药物的作用靶点，快速筛选出副作用少、抗肿瘤疗效高的小分子抗肿瘤药物。

附图说明

图1(A)是(1S)-喹啉-4-基(5-乙烯基奎宁-2-基)甲醇(辛可宁)的分子结构式及其与TRAF6的结合位点；(B)是(1R)-(6-甲氧基喹啉-4-基)((1S,4S,5R)-5-乙烯基奎宁-2-基)甲醇(奎宁)的分子结构式及其与TRAF6的结合位点；(C)为(S)-(6-甲氧基喹啉-4-基)((1S,2R,4S,5R)-5-乙烯基奎宁-2-基)甲醇(奎宁丁)的分子结构式及其与TRAF6的结合位点。

图2辛可宁(图中A)、奎宁(图中B)、奎宁丁(图中C)对子宫颈癌细胞系Hela细 胞的生长抑制作用，加药后(a)72小时(h)，(b)96h，用MTT法测定的细胞生长状况。

图3辛可宁(图中A)、奎宁(图中B)、奎宁丁(图中C)对肺癌细胞系A-549细胞的生长抑制作用，加药后(a)72h，(b)96h，用MTT法测定的细胞生长状况。

图4培养Hela细胞添加不同浓度化合物后48h，用流式细胞仪检测AnnexinV和PI的表达(a)辛可宁，(b)奎宁和(c)奎宁丁诱导细胞早期凋亡的作用。

图5培养A549细胞的Bax/Bcl的表达，(a)加奎宁12h、24h、48h、72h和96h后，(b)(a)图中的条带用ImageJ软件(National Institutes of Health)半定量测定后，计算Bax/β-actin和Bcl/β-actin的比值用柱状图表示。

图6加1.5×10^-4mol/L的奎宁分别刺激3、6、12和24h，再加20μg/ml的LPS刺激3h后，Western blot法测定磷酸化Akt(pAkt)的结果，柱状图是用ImageJ软件(National Institutes of Health)半定量测定pAkt和β-actin的条带(a)为A-549细胞(b)为Hela细胞

图7培养Hela细胞加化合物奎宁作用3,6,12,24h后，提取蛋白质用TRAF6抗体进行免疫共沉淀后检测Akt表达，(a)五个条带分别为：1：空白对照；2，加奎宁后3h；3：加奎宁后6h；4：加奎宁后12h；5：加奎宁24h；(b)用ImageJ软件(National Institutes of Health)半定量测定Akt和TRAF6的条带，柱状图表示Akt/TRAF6的比值。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。本发明的实施例是为了使本领域的技术人员能够实施，但并不对本发明作任何限制。其中的常用试剂的公开了是为了使本领域的技术人员更好的实施本发明，但并不对本发明作任何限制。

实施例1