[发明专利]棉属AD或ADE背景下同时鉴别各亚组全套染色体的BAC‑FISH方法

说明书

技术领域

本发明属于分子细胞遗传学领域，具体涉及棉属AD或ADE背景下同时鉴别各亚组全套染色体的BAC-FISH方法。

背景技术

荧光原位杂交(FISH)技术能够将DNA序列定位于染色质、染色体或DNA纤维上，是一种有效而精确的分子细胞遗传学方法。植物基因组测序是进行功能基因组研究的需要，遗传距离和物理距离之间的分歧，限制了连锁图在指导基因组序列装配、图位克隆等方面的应用。而细胞遗传学图谱代表的是DNA序列在染色体上的实际位置，是基因组物理图谱的类型之一，因此也是基因组测序及序列装配的基础。通过BAC-FISH将DNA克隆直接定位到染色体上是当前构建覆盖整条染色体或整个基因组的物理图谱主要方法之一。

在植物细胞遗传学定位中应用了多种DNA探针，其中以单拷贝DNA序列筛选基因组BAC文库，获得的BAC克隆作为原位杂交探针的BAC-FISH技术，由于其DNA插入片段在100kb以上，用作探针与靶DNA杂交时，增加了与靶序列相遇的机会，信号强度与检出率大大提高，促进了该技术在植物基因组研究中的应用。

FISH技术的发展，使得越来越多的FISH标记被开发出来，如各种rDAN、染色体特异BAC克隆等，应用于染色体识别、核型分析、系统进化及亲缘关系分析、异源染色质鉴定和转基因鉴定、基因定位和物理图谱构建等研究领域。

棉属多倍体属于异源起源，在AD或ADE背景下同时鉴别各亚组全套染色体，传统细胞学方法是依照核型图像染色体的长短确定，随着FISH技术的逐渐发展，以其供体gDNA为探针的GISH技术可以实现亚基因组组成的识别。棉属富含酚类、多糖等高分子次生化合物，对取材、材料存放及提取操作要求严格，因此gDNA提取与纯化较其它物种复杂很多。尤其是ADE背景的异源多倍体，涉及3个基因组来源，需要2-3个gDNA双色或多色探针方能实现亚组染色体的识别，工作量、技术要求、试剂成本相应提高。而BAC-DNA的提取与纯化规避了上述障碍，可以作为理想的FISH标记。

发明内容

本发明的目的是提供一种在棉属AD或ADE背景下同时鉴别各亚组全套染色体的方法。

本发明首先筛选到鉴别棉花AD基因组及A、D亚基因组染色体的FISH探针。该探针是通过SSR引物Gh216对阿非利加棉BAC文库进行筛选，得到的阳性BAC克隆。引物序列信息：

Forward Primer:TCCACATTCCCATGCACTACTC

Reverse Primer:CTAAAACCTTATACATACAAAATGCAGC

该引物PCR扩增的片段长度约为90bp，序列为：TCCACATTCCCATGCACTACTCAATTTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTTTCTTGCTGCATTTTGTATGTATAAGGTTTTAG。扩增产物经8％聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果如图1所示。

对该BAC克隆进行质粒DNA提取，以BAC-DNA作为探针，对不同棉种体细胞中期染色体进行荧光原位杂交(FISH)，结果表明：该探针在5个四倍体棉种的A亚组全套染色体除两近端部以外的染色体大部分区域有明显信号，在D亚组全套染色体近中部一小部分有信号；当该探针对陆地棉((AD)₁)与司笃克氏棉(E₁)的6倍体杂种(AADDEE)根尖制片进行杂交时，清楚地把AADD染色体从6倍体染色体中区分开来，实现了A、D、E三套亚组染色体的同时鉴别(图2)。

根据本发明的具体实施方式，所述BAC-FISH方法包括以下步骤：

1)取材及预处理：取种子在温水中浸泡过夜，种植于灭菌潮湿的沙土中，然后在光照培养箱里28-30℃培养，待根长至1～2cm时，截取根尖用25ppm放线菌酮25℃下处理2h，然后用蒸馏水冲洗，用卡诺固定液固定24h以上，备用；

2)酶解：取出固定好的根尖，用蒸馏水冲洗数次，混合酶液(2％纤维素酶+1％果胶酶)处理，37℃，45min；

3)制片：用60％乙酸进行压片，保留下好的制片在-80℃冷冻4h以上；取出后，迅速揭掉盖片，80℃烤干，4℃保存备用；